Met de snelle ontwikkeling van Peiwit Swetenschap, eiwitzuiveringstechnologie speelt een steeds belangrijkere rol in het veld van biologisch onderzoek en de biotechnologische industrie. Als kerntechniek omvat het de integratie van de coderingsinformatie van het doeleiwit in de gastheercellen door middel van genetische manipulatiemethoden, zodat ze kunnen worden aangezet om efficiënt de vereiste eiwitten te produceren. Vervolgens worden een reeks geavanceerde in vitro-bewerkingsstappen uitgevoerd om de extractie van eiwitten met een hoge zuiverheid te bereiken. Eiwitzuivering stelt wetenschappers in staat om afzonderlijke typen eiwitten te isoleren, wat cruciaal is voor diepgaande studies naar de structuur en functie van eiwitten, de ontwikkeling van nieuwe medicijnen, de diagnose van ziekten en de promotie van de toepassing van biotechnologie. Deze technologie zorgt niet alleen voor de nauwkeurigheid van wetenschappelijke experimenten, maar stimuleert ook voortdurend de ontwikkeling van de levenswetenschappen.
Figuur 1. Schematisch diagram van affiniteitschromatografie[1]
Op het gebied van proteïne-engineering dienen fusietags als een krachtig hulpmiddel, dat verschillende experimentele doeleinden kan vergemakkelijken door te binden aan de doelproteïnen. De functies van veelvoorkomende fusietags worden in de onderstaande tabel vermeld ter referentie. Echter, zodra deze tags op de fusie-eiwitten blijven zitten nadat ze hun initiële hulpfuncties hebben vervuld, kunnen ze nadelige effecten hebben op volgende experimenten, zoals het verstoren van dierlijke immunologische experimenten of het beïnvloeden van de biologische activiteit van eiwitten. Daarom is het cruciaal om deze onnodige fusie-tags te verwijderen om de normale functie van eiwitten en de nauwkeurigheid van experimenten te garanderen.
Tabel 1. Inleiding tot de functies van gangbare fusietags en enzymsplitsingsmethoden
| Fusie-tag | Maat (KDA) | Functie | Veelvoorkomende enzymatische splitsingsmethoden |
| Zijn | 0,84 | Gunstig voor zuivering, kan oplosbare/insluitlichaam-eiwitten zuiveren. | TEV-protease |
| Vlag | 1.01 | Het doelproteïne gefuseerd met Fvertraging tag kan herkend worden door het antilichaam tegen Fvertraging, zodat het fusie-eiwit dat F bevatvertraging tag kan worden gedetecteerd en geïdentificeerd door Western Blot, ELISA en andere methoden. | Enterokinase |
| BTW | 26 | Verbetert de oplosbaarheid van eiwitten, kan alleen oplosbare eiwitten zuiveren en giftige eiwitten afschermen. | Trombine |
| MBP | 44.4 | Verbeter de oplosbaarheid van eiwitten en giftige eiwitten afschermen. | TEV-protease |
| NusA | 55 | Verbeter de oplosbaarheid van eiwitten en giftige eiwitten afschermen. | Trombine |
| SUMO | 11.2 | Verbeter de oplosbaarheid van eiwitten, bevorder de proteolytische afbraak van eiwitten hydrolyse en verbetering van de stabiliteit van eiwitten. | SUMO-protease |
Vandaag zijn we verheugd om u een geavanceerd product voor te stellen voor de efficiënte en nauwkeurige verwijdering van fusie-tags - UCF.METM rTEV Protease. Met zijn eenvoudige en gemakkelijk te bedienen experimentele procedure kan dit enzym op handige wijze onnodige tags van fusie-eiwitten afsplitsen, waardoor zeer zuivere doeleiwitten worden verkregen.
UCF.METM rTEV-protease
TEV Protease is een protease die veel wordt gebruikt voor de splitsing van recombinante proteïnefusietags, bekend om zijn hoge sitespecificiteit. Het herkent strikt de zeven-aminozuursequentie EXXYXQ↓(G/S) en voert nauwkeurige splitsing uit tussen glutamine en glycine of serine. De meest voorkomende zeven-aminozuursequentie is Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly. Deze specificiteit zorgt voor de nauwkeurigheid en efficiëntie in de proteïneverwerkingsprocedure.
Figuur 2. Schematisch diagram van het werkingsmechanisme van TEV-protease[2]
UCF.METM rTEV Protease is een recombinant protease dat genetisch is gemanipuleerd en fijn gezuiverd. Het behoudt niet alleen de volledige functionele activiteit van het natuurlijke TEV-enzym, maar vertoont ook uitstekende stabiliteit en specificiteit over een breder temperatuurbereik. De gastheer gDNA residu van tzijn product is erg laag, wat zorgt voor een hogere snij-efficiëntie van proteïnefusietags in praktische toepassingen en effectief het risico op introductie van exogene stofresten vermindert. UCF.METM rTEV Protease vertoont optimale activiteit onder de omstandigheden van pH 7,0 en 30 °C. Het behoudt echter activiteit zelfs onder een breed scala aan omstandigheden met pH 6,0-8,5 en temperatuur 4-30 °C, om te voldoen aan de verschillende vereisten voor eiwitverwerking. Het is vermeldenswaard dat UCF.METM rTEV-protease heeft een 6×His-tag aan de N-terminus, die efficiënt kan worden verwijderd door Ni-NTA-hars, waardoor een nauwkeurige zuivering van het doeleiwit wordt bereikt.
Prestatieweergave
1. Hoge splitsingsefficiëntie: het eiwitlabel wordt grondiger gekliefd
Met behulp van het fusie-eiwit (3 μg) dat de UCF.ME bevatTM rTEV Protease-splitsingsplaats als substraat, UCF.METM rTEV Protease bij respectievelijk 10, 5 en 3 U werd toegevoegd en de reactie werd uitgevoerd bij 30°C gedurende 1 uur. Het splitsingseffect werd gedetecteerd door agarosegelelektroforese. De resultaten toonden aan dat Yverlichten's UCF.METM rTEV-protease kon het substraat efficiënt splitsen als de invoerhoeveelheid meer dan 3 U bedroeg, met een splitsingsefficiëntie van >90%.
Figuur 3. Verificatie van de splitsingsactiviteit van UCF.METM rTEV-protease
2. Laag gastheer-gDNA-residu: verminder effectief het risico op introductie van exogene substantieresiduen
Door de host te testen (E. coli) gDNA-residuen in verschillende batches van UCF.METM rTEV Protease, de resultaten toonden aan dat het gastheer-gDNA-residu van UCF.METM rTEV-protease lag ver onder de <1 kopie/E.
Figuur 4. De resultaten van gastheer-gDNA-residu in UCF.METM rTEV-protease
3. Brede toepassingsomstandigheden: Kan voldoen aan verschillende vereisten voor eiwitverwerking.
Door de splitsingsactiviteit van UCF.ME te verifiërenTM rTEV-protease onder verschillende omstandigheden lieten de resultaten zien dat UCF.METM rTEV-protease vertoonde een sterke activiteit onder omstandigheden van 4-30°C, waardoor aan de verschillende toepassingsvereisten van klanten kon worden voldaan.
| Reactietijd (H) | Splijtingsactiviteit bij verschillende temperaturen (%) | |||
| 4℃ | 16℃ | 21℃ | 30℃ | |
| 1 | 34 | 58 | 56 | 85 |
| 2 | 58 | 80 | 78 | 90 |
| 3 | 71 | 99 | 99 | 99 |
| 3.5 | 84 | 99 | 99 | 99 |
Ikverlichten's aanbevolen fusie tag snijdende eiwitproducten
| Product Naam | Product Nomber | |
| TEV Protease | UCF.METM rTEV-protease | 20427EN |
| Enterokinase | Enterokinase, recombinant | 20395ES |
| SUMO-protease | SUMO-protease | 20410ES |
| 3C-protease | 3C-protease | 20409ES |
Referenties:
[1] Parikh I, Cuatrecasas P. Affiniteitschromatografie[J]. Vox Sanguinis, 1972, 23(1-2):141-146. DOI:10.1159/000466530.
[2] Paththamperuma C, pagina R C. Fluorescentie-dequenching-test voor de activiteit van TEV-protease[J]. Analytical biochemistry, 2022, 659: 114954.