RNase HII, ook bekend als RNase H2, is een endoribonuclease die specifiek de fosfodiesterbinding aan het 5'-uiteinde van een solitaire ribonucleotide in een dubbelstrengs DNA-helix target en verbreekt, wat resulteert in een 5'-fosfaatgroep en een 3'-hydroxylgroep (Figuur 1). Dit enzym vertoont minimale splitsingsactiviteit ten opzichte van enkelstrengs RNA en is inactief tegen zowel dubbelstrengs DNA (dsDNA) als enkelstrengs DNA (ssDNA). RNase HII is functioneel actief binnen het temperatuurbereik van 50°C tot 75°C en bereikt piekprestaties bij temperaturen tussen 70°C en 75°C. Door gebruik te maken van zijn unieke vermogen om gerichte, enkelvoudige splitsing uit te voeren op DNA-locaties waar een ribonucleotide is geïntegreerd, zonder dsDNA of ssDNA te beïnvloeden, dient RNase HII als een nauwkeurige "trigger" voor reactie-initiatie, inclusief primeractivering en -extensie, om specifieke amplificatie te bereiken. Dit enzym speelt een cruciale rol in RNase H-afhankelijke PCR (rhPCR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-technologie en de afbraak van RNA-componenten in Okazaki-fragmenten.
Figuur 1. Schematisch diagram van het RNase HII-reactieprincipe
De functionele toepassingen van RNase HII
一. RNase H-afhankelijke PCR(rhPCR)
De rhPCR integreert RNase HII en speciaal ontworpen, gesloten splitsbare rhPCR-primers in het PCR-proces. Deze aanpak maakt gebruik van de unieke eigenschap van RNase HII om selectief RNA te hydrolyseren in DNA-RNA-hybriden, terwijl de fosfodiësterbindingen in enkelstrengs of dubbelstrengs DNA en RNA intact blijven. Als gevolg hiervan verteert RNase HII alleen de DNA-RNA-hybride en staat primer-extensie toe wanneer de primer perfect complementair is aan de doel-DNA-sequentie. Deze gerichte actie verbetert de nauwkeurigheid van de reactie aanzienlijk. RNase HII is het enige enzym dat in staat is om de precieze verwijdering van ribonucleotiden te initiëren zonder mutaties te induceren door te splitsen aan het 5'-uiteinde van ribonucleïnezuur. Vanwege zijn hoge specificiteit, gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt rhPCR duidelijke voordelen in toepassingen zoals detectie van enkelvoudige nucleotidepolymorfie (SNP), gentypering, gelijktijdige detectie van meerdere doelen en analyse van omgevingsnucleïnezuur.
Technische route
1. Primerontwerp
Het primerontwerp moet ervoor zorgen dat de smelttemperatuur na het snijden hoger is dan de annealingtemperatuur om ervoor te zorgen dat de primer stabiel aan de template bindt tijdens PCR-cycli. De rhPCR-primer bestaat uit drie delen:
1) 5'-DNA-segment: Vergelijkbaar in lengte en smelttemperatuur (Tm) met standaard PCR-primers. Het kan effectief paren met en zich uitstrekken vanaf het template-DNA nadat het is geknipt door het RNase HII-enzym.
2) Een enkele RNA-base: biedt een knipplaats voor RNase HII.
3) 3'-DNA-segment: Een stuk van vier of vijf basen met een blokker, meestal een kort, niet-uitrekbaar molecuul zoals propyleenglycol, dat de uitrekbaarheid van DNA-polymerase voorkomt totdat de blokkering wordt verwijderd.
2.Snijden en verlengen
Bij de start van de rhPCR-reactie zijn de primer en template-DNA vrij. Wanneer de primer zich bindt aan de specifieke RNA:DNA heteroduplex template, wordt de RNA base 5'-zijde van de geblokkeerde primer herkend en geknipt door het RNase HII-enzym, waardoor een DNA-oligonucleotide met een 3'-hydroxylgroep overblijft, wat een startpunt biedt voor DNA-polymerase om uit te breiden. Dit wordt gevolgd door het conventionele PCR-amplificatieproces.
Figuur 2. Diagram van het rhPCR-principe [1]
Mensen.Lus-gemedieerde isotherme versterking (LAMP)
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is een eenvoudige en snelle methode voor genamplificatie die nucleïnezuren kan amplificeren onder isotherme omstandigheden in een korte periode. Echter, door de initiatie van DNA polymerase activiteit tijdens de voorbereiding bij kamertemperatuur, worden er niet-specifieke mismatches gevormd, wat kan leiden tot een kleine hoeveelheid mispairing en primer dimeren, wat kleine verontreinigingen veroorzaakt die kunnen resulteren in vals-positieve resultaten.
Toepassing van RNase HII op het LAMP-amplificatiesysteem kan effectief het probleem van vals-positieve resultaten in LAMP-technologie aanpakken, waardoor de toepassing ervan in klinische diagnostiek wordt uitgebreid. Zoals getoond in Afb. 3, de primer-geactiveerde LAMP-methode (PA-LAMP) met RNase HII, wanneer de primer paart met het doel-ssDNA, splitst het RNase HII-enzym specifiek het RNA op de primer, activeert het en staat primer-extensie toe, waardoor specifieke amplificatie wordt bereikt en vals-positieve resultaten in het systeem effectief worden verminderd.
Figuur 3. Schematisch diagram van het PA-LAMP-principe [2]
Yeasen RNase-HII
1. E. coli genomische DNA-residu < 0,5 kopieën/100 U
Detectie van E. coli genomische DNA-residuen in verschillende batches van RNase HII toonden aan dat de gastheergenomische DNA-residuen van
Figuur 4. Detectie van E. coli genomische DNA-rest
2. 95°C hittebestendigheidstest
Na het verwarmen van RNase HII op 95°C gedurende 0 tot 45 minuten werd de enzymactiviteit van RNase HII getest. De resultaten gaven aan dat er vrijwel geen verlies van enzymactiviteit was in
Figuur 5. Hittebestendigheidstest van 95°C
3. Geen exonuclease, nicking-enzym of RNase-residu (1 U-dosis)
Door 1 U van verschillende batches RNase HII te incuberen met hun respectievelijke substraten DNA/RNA bij 37 °C gedurende 4 uur, gaven de resultaten van agarosegelelektroforese aan dat er geen exonuclease, nicking-enzym of RNase-residu in RNase HII aanwezig was.
Figuur 6.Detectieresultaten van exonuclease, nicking-enzym en RNase-residu
Aanbevolen gerelateerde producten
| Producttoepassing | Productnaam | Catalogusnummer |
| rhPCR, LAMP | 14539ES 14541ES | |
| rhPCR | 10101ES | |
| RT-LAMP | 14402ES | |
| 11111ES |
Referenties
[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. RNase H-afhankelijke PCR (rhPCR): verbeterde specificiteit en detectie van enkelvoudige nucleotidepolymorfisme met behulp van geblokkeerde kliefbare primers. BMC Biotechnol. 2011 10 aug;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF, Ge JH, Li JJ, et al. Enkelvoudige stap, hoge-specificiteitsdetectie van enkele nucleotidemutatie door primer-activeerbare lus-gemedieerde isothermische amplificatie (PA-LAMP)[J].Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.