Figuur 1. Schematisch diagram van DNase I dat dsDNA splitst in aanwezigheid van Mg²⁺ en Mn²⁺

Common DNase I wordt voornamelijk gezuiverd uit runderpancreas of is een recombinant enzym. Vergeleken met DNase I gezuiverd uit runderpancreas, heeft recombinant DNase I relatief lagere endogene RNase-niveaus of kan worden geformuleerd als RNase-vrije producten, waardoor het geschikter is voor RNase-gevoelige toepassingen, zoals het verwijderen van DNA uit RNA-monsters.

Toepassingen

Wat betreft toepassingen is DNase I bekend om zijn gebruik in experimenten met betrekking tot het handhaven van RNA-integriteit, zoals het extraheren van RNA zonder DNA, het voorbereiden van RNA-templates zonder gDNA vóór reverse transcriptie en het afbreken van DNA-templates na in vitro transcriptie. Daarnaast kan het worden gebruikt om DNA-probes te verteren bij het verwijderen van rRNA, voor DNA-labeling via nick-translatie, het analyseren van DNA-proteïne-interacties met behulp van de footprinting-methode, het genereren van willekeurige DNA-bibliotheken, het verminderen van de viscositeit van cellysaten of proteïne-extracten, het verteren van celadhesies als additief in celkweek en het gedeeltelijk splitsen van genomisch DNA als positieve controle in TUNEL-tests voor apoptosedetectie. Samenvattend kan DNase I worden gebruikt in bijna elke toepassing die enzymatische vertering van DNA vereist. Hieronder volgt een korte introductie van verschillende veelvoorkomende toepassingen.

• Verwijdering van gDNA vóór RNA-extractie of reverse transcriptie

RNA, als een veel bestudeerd monster in laboratoria, beïnvloedt de kwaliteit van experimentele data sterk vanwege zijn eigen kwaliteit. Het is over het algemeen onmogelijk om de restanten van gDNA volledig te vermijden tijdens het RNA-extractieproces. Daarom wordt het meestal aanbevolen om RNA-monsters te behandelen met DNase I om restanten van gDNA te verteren voordat uitdagende downstream-toepassingen worden uitgevoerd (zoals mRNA-expressieanalyse, transcriptoomanalyse, enz.). De vertering van gDNA kan worden uitgevoerd tijdens RNA-extractie, na RNA-extractie of vóór RNA-reverse transcriptie.

Figuur 2. DNase I-gebaseerd gDNA-verwijderingsproces

• Verwijdering van template-DNA bij in vitro transcriptie

In vitro transcriptie (IVT) gebruikt voornamelijk DNA als template om RNA te produceren onder invloed van geschikte substraten en buffers. Veelgebruikte RNA-polymerasen in dit proces zijn T7, T3 en SP6, die verantwoordelijk zijn voor het katalyseren van RNA-synthese. Het gesynthetiseerde RNA-product kan echter DNA-residuen bevatten en het elimineren van deze residuen is gunstig voor downstream-experimenten.

Vooral bij de ontwikkeling van mRNA-vaccins is het verwijderen van deze DNA-resten een cruciale stap die direct van invloed is op de moeilijkheidsgraad van de daaropvolgende zuiveringsprocessen en de zuiverheid van het eindproduct.Om template-DNA efficiënt te verwijderen, wordt doorgaans DNase I gebruikt voor de behandeling om ervoor te zorgen dat het RNA-monster vrij is van DNA-resten. Deze stap helpt de algehele nauwkeurigheid en efficiëntie van het experiment te verbeteren.

Figuur 3: In vitro transcriptieproces met behulp van gelineariseerde plasmide als template^[4]

• Verwijdering van rRNA bij de constructie en sequentiebepaling van RNA-bibliotheken

In organismen is rRNA zeer overvloedig en zeer geconserveerd, wat van weinig belang is voor het verkrijgen van biologische informatieonderzoek. Echter, 95% van de totale RNA die tijdens experimenten wordt geëxtraheerd, is menselijk rRNA, en de aanwezigheid van deze rRNA's kan de detectie van doel-RNA's verstoren. Daarom wordt rRNA bij de voorbereiding en sequentiebepaling van RNA-bibliotheken meestal als eerste verwijderd. Momenteel is de belangrijkste methode voor het verwijderen van rRNA RNAase-digestie, en de belangrijkste operationele De stappen en principes zijn als volgt:

1. Totaal RNA extraheren;
2. Hybridiseer enkelstrengs DNA-sondes met rRNA-moleculen (Opmerking: ontwerp en synthetiseer rRNA-specifieke enkelstrengs DNA-sondes);
3. RNase H breekt het gehybridiseerde rRNA af;
4. DNase I breekt de DNA-sondes af;
5. rRNA wordt succesvol verwijderd, waardoor er non-rRNA RNA-sjablonen overblijven.

Figuur 4: Schematisch diagram van het rRNA-verwijderingsprincipe op basis van de enzymatische methode^[5]

• Nick-vertaling voor DNA-labeling

Nick-translatie is de meest gebruikte methode voor het labelen van deoxyribonucleïnezuurprobes in het laboratorium. Deze methode wordt bereikt door de gecombineerde werking van DNase I en E. coli DNA-polymerase I.

Het hoofdprincipe is als volgt:

1. Gebruik eerst een geschikte concentratie DNase I om meerdere enkelstrengs nicks te maken in elke streng van het dubbelstrengs DNA dat gelabeld moet worden, zodat er 3'-hydroxyltermini ontstaan ​​op de nick-locaties.
2. Gebruik vervolgens de 5'→3' exonuclease-activiteit van coliDNA-polymerase I om een ​​nucleotide van het 5'-uiteinde van de nick te verwijderen, terwijl de 5'→3'-polymeraseactiviteit van E. coli DNA Polymerase I introduceert een gelabelde nucleotide aan het 3'-uiteinde van de nick om deze te repareren. Terwijl de nick langs de DNA-streng beweegt, worden de gelabelde nucleotiden opgenomen in de nieuw gesynthetiseerde DNA-streng.

Figuur 5: Schematisch diagram van het principe van DNA-labeling door nick-translatie^[6]

• Experiment met DNase I-voetafdrukanalyse

De DNase I footprinting assay is een nauwkeurige methode voor het identificeren van de bindingsplaatsen van DNA-bindende eiwitten op DNA-moleculen. Het principe is dat eiwitten die gebonden zijn aan een DNA-fragment, de gebonden regio beschermen tegen afbraak door DNase I. Na enzymatische vertering kan het resterende fragment (de "footprint") worden gebruikt om de sequentie ervan te bepalen. In de gelafbeelding zijn er geen banden die overeenkomen met de regio's waar het eiwit gebonden is.

Het hoofdprincipe is als volgt:

1. Markeer de enkelstrengs uiteinden van het dubbelstrengs DNA-molecuul dat u wilt testen.
2. Meng het eiwit met DNA en voeg een geschikte hoeveelheid DNase I toe voor enzymatische vertering, waardoor DNA-fragmenten van verschillende lengtes ontstaan.De hoeveelheid enzym moet worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat aangrenzende DNA-fragmenten slechts één nucleotide verschillen. Daarnaast moet er een controlefragment zonder toegevoegd eiwit worden toegevoegd.
3. Verwijder het eiwit uit het DNA, scheid het gedenatureerde DNA door middel van PAGE-elektroforese en voer een autoradiografie uit om de nucleotidesequentie van de voetafdrukregio te interpreteren door deze te vergelijken met de controlegroep.

Figuur 6: Schematisch diagram van het principe van de DNase I-footprinting-test^[7]

De DNase I Selectiegids van Yeasen

Om aan verschillende toepassingsbehoeften te voldoen, Yeasen aanbiedingen recombinant DNase I in E. colien kan GMP-kwaliteit DNase I leveren om te voldoen aan de eisen van mRNA in vitro transcriptie en andere toepassingen.

Productpositionering	Sollicitatie	Productnaam	catalogusnummer
RNase-vrij	het verwijderen van DNA uit RNA- en eiwitpreparaten	Recombinant DNase I (RNase-vrij)	10325ES
GMP-kwaliteit, RNase-vrij	In vitro transcriptie van mRNA	UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-kwaliteit	10611ES

Referenties

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. HPV DNA, E6/E7 mRNA, en p16INK4a detectie bij hoofd- en halskankers: een systematische review en meta-analyse[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Vergelijking van oncogene HPV-typespecifieke virale DNA-belasting en E6/E7 mRNA-detectie in baarmoederhalsmonsters: resultaten van een multicenterstudie[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Optimalisatie van Dnase I-verwijdering van verontreinigend DNA uit RNA voor gebruik in kwantitatieve RNA-PCR[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Vooruitgang van in vitro getranscribeerd mRNA (IVT mRNA) om vertaling naar de kliniek mogelijk te maken[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Onomkeerbare hitte-inactivatie van DNase I zonder RNA-afbraak[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. In situ nick-translatie van metafasechromosomen met biotine-gelabelde d-UTP[J]. Human genetics, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Het kiezen van een geschikte methode voor de identificatie van replicatieoorsprongen in microbiële genomen. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.