- RT-qPCR aangestuurd door zeer efficiënte reverse transcriptase
Reverse transcriptase (RT-enzym) is een enzym dat RNA-templates kan omzetten in complementair DNA (cDNA). In moleculair biologisch onderzoek wordt reverse transcriptase veel gebruikt, met name in het veld van moleculaire diagnostiek. Door het proces van reverse transcriptie kan het RNA-genoom van virussen worden omgezet in cDNA, dat vervolgens kan worden versterkt en gedetecteerd met behulp van technieken zoals qPCR. Deze eigenschap maakt een nauwkeurige diagnose van RNA-virussen mogelijk, zoals HIV, influenza A en influenza B.
Figuur 1. Schematisch diagram van het omgekeerde transcriptieproces
De zoektocht naar RT-qPCR moleculaire diagnostische reagentia die sneller, gevoeliger en gemakkelijker te bedienen zijn, is de huidige grote trend in ontwikkeling geworden. Als een van de belangrijkste grondstoffen in het RT-qPCR-proces, moet reverse transcriptase een hogere reverse transcriptiesnelheid, hogere syntheseopbrengst en betere hittebestendigheid bezitten. Om een reverse transcriptase te verkrijgen die geschikter is voor RT-qPCR,
Figuur 2. Schematische weergave van de werking van reverse transcriptie
Hifair™Omgekeerde transcriptasen
| Productnaam (Productnummer ) | Producteigenschappen | Aanbevolen toepassing |
| Thermisch stabiel (tot 65°C), geschikt voor complexe sjablonen | RT-LAMP | |
| Sterke compatibiliteit, hoge snelheid en hoge syntheseopbrengst | Eén stap RT-PCR/qPCR |
Let op: Alle hierboven genoemde enzymen zijn verkrijgbaar in hoge concentraties of in niet-glycerolformuleringen.
We belichten nu een reverse transcriptase die wordt gebruikt in RT-qPCR moleculaire diagnostische reagentia: HifairTM V Reverse Transcriptase. Dit enzym onderscheidt zich door zijn sterke compatibiliteit, hoge snelheid en hoge syntheseopbrengst, en is in staat om reactietemperaturen tot 58°C te doorstaan. Het is met name geschikt voor de ontwikkeling van RT-qPCR moleculaire diagnostische reagentia.
Prestatiedemonstratie van Hifair™ V-reverse transcriptase
1. Het is bestand tegen een reactietemperatuur van 58°C en is geschikt voor de omgekeerde transcriptie van complexe RNA-sjablonen.
Figuur 3. De reverse transcriptase van HifairTM V Reverse Transcriptase en het merk T* werden respectievelijk 30 min. bij 55℃ en 58℃ geïncubeerd om de resterende enzymactiviteit te detecteren. De resultaten toonden aan dat HifairTM V Reverse Transcriptase kon nog steeds 70% activiteit behouden na incubatie bij 58℃ gedurende 30 minuten, wat veel hoger was dan die van het merk T*.
2. Het detectiepercentage van RT-qPCR was beter dan dat van andere merken,en tHet detectiebereik was 1 pg-1 μg.
Figuur 4. Met behulp van 1 pg-1 μg (7 gradiënten) totaal RNA van 293T-cellen als template, werd reverse transcriptie uitgevoerd met behulp van HifairTM V one-step RT-gDNA digestie SuperMix voor qPCR (Cat#11142), V*, T*. De verkregen cDNA werd kwantitatief geanalyseerd door qPCR. De resultaten toonden aan dat de gevoeligheid van 11142ES 1 pg kon bereiken, wat beter was dan die van andere merken.
De reverse transcriptase mutantbibliotheek van Yeasen
Tabel 2. De Gids voor selectie van reverse transcriptase-mutanten van
Aanbevolen producten
| Productclassificatie | Productnaam | Catalogusnr. |
| Hoogwaardige PCR-enzymserie | 10726ES | |
| 11300ES | ||
| 14455ES | ||
| 10603ES | ||
| 10125ES |