Met de snelle ontwikkeling van glycoproteomics en antilichaamgeneesmiddelenonderzoek heeft glycosyleringsmodificatie ook veel aandacht getrokken. Het contact tussen cellen en cellen, en tussen cellen en pathogenen, wordt voornamelijk voltooid door de interactie van suikers en eiwitten, en glycosylering bepaalt de adhesie-eigenschappen van glycoconjugaten. In IgG is de geconserveerde N-gekoppelde glycosylering bij Asn297 in de Fc-regio ook cruciaal voor zijn activiteit. Bovendien hebben sommige antilichamen ook extra N-glycanen, die samen met de geconserveerde site bij Asn297 in de Fc-regio de herkenning, halfwaardetijd en immuunrespons van het antilichaam beïnvloeden.
Proteïneglycosylering is een complexe post-translationele modificatie die de verbinding van glycaanketens op specifieke plaatsen op eiwitten omvat. Afhankelijk van het type glycaanketen worden glycoproteïnen verdeeld in N-gekoppelde glycoproteïnen, O-gekoppelde glycoproteïnen, enz.; bovendien wordt proteïneglycosylering ook beïnvloed door het type gastheercel en fermentatieomstandigheden (zoals kweekmedium, pH-waarde, temperatuur, enz.). Daarom hebben glycoproteïnen meestal heterogeniteit in glycosyleringspatronen, inclusief glycosyleringsplaatsen, glycosyleringsniveaus en de specifieke structuur van glycaanketens, waardoor glycaanketenanalyse en structurele karakterisering extreem uitdagend werk zijn. Om de maximale hoeveelheid structurele informatie over glycaanketens te verkrijgen, is de belangrijkste strategie van glycaanketenanalyse om eerst de glycaanketens van de eiwitten los te maken en vervolgens gedetailleerde analyse en karakterisering uit te voeren. Bij deze strategie is een efficiënte, nauwkeurige en stabiele deglycosyleringsmethode cruciaal.
Enzymatische methoden worden momenteel op grote schaal gebruikt voor deglycosylering.
Glycoproteïnen kunnen worden ingedeeld in N-gebonden en O-gebonden glycopeptiden op basis van hun type glycaanketens. Voor N-gebonden glycopeptiden zijn de meest gebruikte enzymen peptide N-glycosidase F (PNGase F), endoglycosidase H (Endo H) en endoglycosidase S (Endo S). PNGase F hydrolyseert de GlcNAc-Asn-binding en kan hoge mannose-, complexe en hybride glycaanketens verwijderen. Endo H splitst glycosidische bindingen binnen de N-glycaanketenpentasaccharidekern. Endo S splitst specifiek N-gebonden glycanen van de chitobiosekern van de zware keten van natuurlijk IgG.
Figuur 1. Knipplaats van PNGase F, Endo H en Endo S.
Onder hen is PNGase F is de meest effectieve enzymatische methode voor het verwijderen van bijna alle N-gebonden oligosacchariden in glycoproteïnen, die high-mannose, hybride en complexe oligosaccharide glycoproteïnen kunnen splitsen die verbonden zijn door asparagine, waarbij specifiek N-gebonden glycanen worden verwijderd. De splitsingsplaats is: de amidebinding tussen de binnenste N-acetylglucosamine (GlcNAc) en het asparagineresidu, terwijl de asparagine op het eiwit na enzymatische hydrolyse wordt omgezet in asparaginezuur.
Wanneer α1-6-fucose zich in de GlcNAc-kern bevindt, kan PNGase F ook knippen. Alleen wanneer α1-3-fucose zich in de GlcNAc-kern bevindt (veelvoorkomend in glycoproteïnen van planten en insecten), kan PNGase F niet knippen.
De conventionele PNGase F enzymatische reactie heeft echter meerdere uren nodig om antilichaam N-glycanen vrij te maken, en vanwege de voorkeur voor glycanvrijmaking kan onvolledige deglycosylering leiden tot bevooroordeelde resultaten, en de verkregen glycanverdeling vertegenwoordigt mogelijk niet de juiste samenstelling van therapeutische antilichamen. Daarom is het verkrijgen van een nauwkeurig N-glycanprofiel zo snel mogelijk cruciaal voor glycosyleringsbewaking tijdens het productieproces van antilichamen en antilichaamfusie-eiwitten en andere biotherapeutische middelen.
Snelle PNGase F
Fast PNGase F is een geoptimaliseerd recombinant reagens dat snel en volledig antilichamen, immunoglobulinen, fusie-eiwitten en andere glycoproteïnen kan deglycosyleren in een paar minuten. Dit enzym kan snel en zonder voorkeur alle N-glycanen verwijderen en kan direct worden gebruikt voor downstream chromatografie of massaspectrometrie-analyse.
Producteigenschappen:
Snel: Volledige en snelle deglycosylering in enkele minuten.
Hoge zuiverheid: Geen protease- of glycosidaseverontreiniging, zuiverheid ≥95%.
Niet-selectief: Verwijder snel en zonder voorkeur alle N-glycanen.
Goede compatibiliteit: Direct gebruikt voor downstream chromatografie of massaspectrometrie-analyse.
Testgegevens:
Eén-staps eiwitdeglycosylering:
- 10 ug substraat/100 ug antilichaam en ddH2O gemengd tot een totaal volume van 16 uL;
- Voeg 4 μL Fast PNGase F Buffer (5x) toe, eindvolume 20 uL;
- Voeg 1 μL Fast PNGase F toe.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 50°C.
Figuur 2. Eenstaps enzymatisch splitsingseffect op eiwitsubstraat (A) en antilichaam (B).
1: ProteïnemarkerCat#20350ES) 2: Concurrent + substraat of antilichaam 3: Concurrent + substraat of antilichaam 4:
Tweestaps-deglycosylering van eiwitten:
- 10 ug substraat/100 ug antilichaam en ddH2O gemengd tot een totaal volume van 16 uL;
- Voeg 4 μL Fast PNGase F Buffer (5x) toe, eindvolume 20 uL;
- Laat 2 minuten op 80°C incuberen en laat afkoelen tot kamertemperatuur.
- Voeg 1 μL Fast PNGase F toe.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 50°C.
Figuur 3. Twee-staps enzymatisch splitsingseffect op eiwitsubstraat (A) en antilichaam (B).
1: ProteïnemarkerCat#20350ES) 2: Concurrent + substraat of antilichaam 3: Concurrent + substraat of antilichaam 4:
Conclusie:
-
Yeasen Fast PNGase F heeft dezelfde of een hogere enzymatische splitsingsefficiëntie als geïmporteerde concurrenten onder dezelfde reactieomstandigheden; - Het wordt aanbevolen om een enzymatische splitsing in twee stappen uit te voeren om een hogere enzymatische splitsingsefficiëntie te garanderen. Sommige antilichamen (zoals Fab N-glycosylering) vereisen een voorverwarmingsstap
voor efficiënte deglycosylering.
In aanvulling,
Aankoopgids
| Productnummer | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Productnaam | Snel PNGase F | PNGase F | Endo-H | Endo S |
| Bron | Gist recombinante expressie | Gist recombinante expressie | Gist recombinante expressie | E. coli recombinante expressie |
| Specifieke activiteit | Niet van toepassing | 100000 U/ml | 1000000E/ml | 8000 eenheden/mg |
| Kloofplaats | Bijna alle N-gebonden glycanen | Bijna alle N-gebonden glycanen | N-gebonden hoge mannose glycanen | Splitst binnen de kerndisacharidestructuur van de zware keten van IgG |
| Spijsverteringstijd | 10 minuten | 1-3 uur | 1-3 uur | 1 uur |
| Glycosylering | Geschikt | Geschikt | Geschikt | Geschikt |
| Eiwitstructuur | Geschikt | Geschikt | Geschikt | Geschikt |
Bestel Informatie
| Productnaam | Productnummer | Specificatie |
| 20406ES20/50 | 20 Ton/50 Ton | |
| 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 eenheden/5 x 1000 eenheden |