Als het gaat om telomeren en protelomerase in de biologie denken mensen vaak als eerste aan veroudering, een onvermijdelijk natuurlijk fenomeen. Telomeren is repetitieve DNA-sequenties aan de uiteinden van eukaryotische chromosomen, die de verantwoordelijkheid voor het handhaven van de integriteit van de chromosomen en het reguleren van de celdelingscyclus.
Protelomerase is een reverse transcriptase DNA-synthese-enzym dat telomeren verlengt. Het is een nucleoproteïne dat bestaat uit RNA en eiwitten. Het eiwitcomponent kan de synthese van telomeer-herhalingssequenties katalyseren met het RNA-component.
Figuur 1. Mechanisme van protelomerase-gemedieerde telomeerextensie[1]
Protelomerase kan telomeren repareren en verlengen, defecten in DNA-replicatie compenseren, telomeerverlies tijdens celdeling voorkomen en het aantal celdelingen verhogen. In 2009 werd de Nobelprijs voor Fysiologie of Geneeskunde toegekend aan Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider en Jack W Szostak voor hun uitstekende bijdragen aan Revealing the crucial role of telomeres and Protelomerase in cellulaire functie en veroudering.
Vandaag wil ik u een unieke Protelomerase voorstellen: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase komt van bacteriofaag N15 en is een onderdeel van het N15-replicatiesysteem, dat deelneemt bij de generatie van lineair profaag-DNA. In tegenstelling tot Protelomerase in eukaryoten is TelN een puur proteïne-enzym zonder RNA-componenten. Het heeft splitsing-ligatie activiteit en laat een covalente gesloten uiteinde achter op de splitsingsplaats na het knippen van dubbelstrengs DNA (dsDNA).
Figuur 2. TelN-protelomerase Kloofplaats
TelN-protelomerase Werkingsmechanisme
De herkenningsplaats van TelN Protelomerase is een palindroomsequentie die 56 bp lang is, met telR en telL aan beide kanten. De centrale positie van de doelsequentie is ook een palindroomsequentie telO. TelN Protelomerase splitst binnen de telO-sequentie en vormt een covalente gesloten haarspeldstructuur aan de twee splitsingsuiteinden. Het uiteinde van het DNA na vertering bestaat nog steeds uit telR en telL, wat bekend staat als hondenbot DNA (dbDNA).
Figuur 3. Protelomerase splitsingsmechanisme op de TelN-site[2]
Door de speciale enzymsplitsing-ligatieactiviteit van TelN Protelomerase kan circulair plasmide-DNA worden omgezet in lineaire covalente gesloten haltervormige moleculen door middel van een enzymatische reactie in één stap. Vergeleken met lineaire open DNA-moleculen heeft lineair gesloten DNA een hoger eiwitexpressieniveau in cellen, wat zeer geschikt is voor het construeren van lineair gesloten eind-mini-DNA met hoge stabiliteit en minimale vreemde sequentie. Plasmide-DNA speelt een cruciale rol als kernelement van mRNA-vaccin, DNA-vaccin en celgentherapie. De traditionele plasmideproductiemethode omvat fermentatie met E. coli en multi-stage amplificatie, en het oncontroleerbare risico in het fermentatieproces beperkt de opbrengst van hoogwaardige plasmiden, wat de sleutel wordt om de productiecapaciteit van vaccins te beperken. Touchlight Company in het Verenigd Koninkrijk heeft een innovatieve dbDNA-technologie gelanceerd. Deze technologie verstoort de traditionele methode van bacteriële fermentatie voor de bereiding van plasmide-DNA en gebruikt in plaats daarvan in vitro enzymatische synthese van DNA. De speciale enzymsplitsing-ligatieactiviteit van TelN Protelomerase wordt ook gebruikt om lineaire gesloten-eind mini-DNA te genereren in de bovenstaande methode.
Toepassing van TelN Protelomerase in DNA-enzymatische synthese
DNA in vitro enzymatische methode gebaseerd op phi29 DNA polymerase en TelN Protelomerase kan veel oncontroleerbare risico's in het biologische fermentatieproces vermijden, en de in vitro enzymatische methode kan DNA synthetiseren met hoge snelheid en hoge opbrengst. Het gesynthetiseerde DNA kan worden gebruikt in veel opkomende technologieën, zoals mRNA-vaccin, DNA-vaccin, gentherapievector en genbewerking.
Figuur 4. Stroomdiagram van DNA-enzymatische synthese[3]
Enzymatisch DNA-syntheseproces
- Sjabloon denaturatie
Het circulaire plasmide-DNA-sjabloon wordt door een denaturatieproces omgezet in twee enkelstrengs circulaire DNA's.
- Rollende cirkelversterking
Amplificatie van de rollende cirkel werd uitgevoerd met behulp van Phi29 DNA-polymerase en enkelstrengs circulair DNA om lang lineair dubbelstrengs concatemeer DNA te genereren met Protelomerase-herkenningssequentie-intervallen.
- Snijden en covalente sluiting
TelN Protelomerase herkent de telRL op het DNA van telomere complexen en voert klieving-ligatieactiviteiten uit om lineaire, covalente verbonden DNA-monomeren te genereren.
- Verwijdering van bacterieel ruggengraat-DNA
Restrictie-endonucleasen of exonucleasen breken het DNA van het bacterieskelet af met een open structuur aan het einde om DNA te verkrijgen dat alleen de expressie-elementen van het doelwitgen bevat. Enzymatische synthese van DNA-technologie omzeilt biologische fermentatie en kan snel GMP-niveau plasmide-DNA-synthese bereiken, waarmee de beperkingen van de productiecapaciteit op het gebied van gentherapie en mRNA-vaccins worden opgelost. Het heeft een enorm potentieel voor industrialisatie. Om de ontwikkeling van DNA-enzymatische synthesetechnologie te bevorderen,
Pprestatie presentatie van
- De prestaties van de splitsingsligatie zijn uitstekend, vergelijkbaar met die van geïmporteerde merken.
Met behulp van een supercoiled plasmide dat de TelN Protelomerase-herkenningsplaats als sjabloon bevat, wordt het gradiëntadditie-enzym (0,078-5 U) van
Figuur 5. Protelomerase-klievingactiviteitsdetectie van TelN M:Marker, C: supercoiled plasmid-controle
- De sluitingsintegriteit van lineair dsDNA > 90%
Door gebruik te maken van de supercoiled plasmide die de TelN Protelomerase-herkenningsplaats bevat als template, wordt TelN Protelomerase van
Figuur 6. Test op integriteit van de eindsluiting van TelN Protelomerase. C1: plasmide met TelN-herkenningsplaats, zonder TelN Protelomerase; C2: plasmide met TelN-herkenningsplaats, TelN Protelomerase, zonder T5-exonuclease; Plasmide: plasmide met TelN-herkenningsplaats.
Gerelateerde producten van DNA-enzymatische synthese
| Productclassificatie | Productnaam | Catalogusnr. |
| Protelomerase | 14540ES | |
| Phi29 DNA-polymerase | 14404ES | |
| Exonuclease | Exonuclease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferenties
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telomeer en Protelomerase biologie. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineair gesloten mini-DNA gegenereerd door het prokaryotische klievende-verbindingsenzym TelN is functioneel in zoogdiercellen. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. Lineair gesloten mini-DNA gegenereerd door het prokaryotische klievende-verbindingsenzym TelN is functioneel in zoogdiercellen. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.