Restrictie-endonucleasen van de Yeasen FuniCut™-serie, 5 minuten digestie met universele buffer
Moleculair klonen wordt in bijna elk laboratorium gebruikt. Restrictie-endonucleasen zijn een cruciaal onderdeel van moleculaire kloneringsexperimenten, maar mensen worden ook vaak lastiggevallen door verschillende problemen met restrictie-endonucleasenexperimenten. Veelvoorkomende problemen zijn als volgt:
- Er zijn zoveel soorten restrictie-endonucleasen dat het moeilijk is om te kiezen.
- Miscleavage, willekeurige splitsing of onvolledige enzymatische splitsing.
- De spijsvertering verloopt traag; het kan een uur of zelfs een hele nacht duren.
- Bovendien moeten experimenten met meerdere enzymvertering ook een verscheidenheid aan enzymverteringsmethoden selecteren
Om u een grondiger begrip van restrictie-endonucleasen te geven, zal het volgende kort uitleggen wat restrictie-endonucleasen zijn en hoe verschillende endonucleasen worden geclassificeerd in antwoord op de eerste vraag.
1. Wat is restrictie-endonuclease?
2. Beperkingen endonuclease-nomenclatuur
3. Beperkingen op endonucleaseclassificatie
4.
1. Wat is restrictie-endonuclease?
Restrictie-endonucleasen zijn een klasse enzymen die specifieke nucleotide-sequenties in dubbelstrengs DNA-moleculen kunnen herkennen en de fosfodiësterverbindingen in DNA-ketens op specifieke plaatsen kunnen verbreken.
Verschillende restrictie-endonucleasen herkennen verschillende DNA-sequenties. Ze kunnen DNA knippen binnen de herkenningssequentie of op een plaats niet ver van de herkenningssequentie, wat resulteert in verschillende producten, zoals geïllustreerd in Figuur 1. BamHI vormt kleverige uiteinden, KpnI vormt 3'-ticky uiteinden en EcoRV vormt stompe uiteinden.
Figuur 1. Schematisch diagram van BamHI, KpnI, EcoRV-vertering
2. Beperkingen endonuclease-nomenclatuur
De geslachtsnaam, soortnaam, bacteriestam of serotype en de volgorde van ontdekking zijn de primaire factoren die worden gebruikt om restrictie-endonucleasen te benoemen. De richtlijnen voor namen worden weergegeven in Tabel 1 hieronder met BstEII als voorbeeld:
Tabel 1. Beperkingen endonuclease-nomenclatuur
| Afkorting | Volledige naam | Implicatie |
| B | Bacil | Eerste letter van de geslachtsnaam |
| st | stearothermophilus | De eerste twee letters van de soortnaam |
| Ik | EN | De eerste letter van de stamnaam |
| Ik | Tweede ontdekking | De orde die in dergelijke bacteriën wordt aangetroffen |
3.Beperkingen op endonucleaseclassificatie
Afhankelijk van de complexiteit van de structuur, de werkingswijze en het verschil tussen de cofactoren, kunnen restrictie-enzymen worden onderverdeeld in vier categorieën. De volgende tabel 2 vat de kenmerken en typische enzymen van elke categorie samen.
Tabel 2. De variaties tussen verschillende restrictie-endonucleasen
| Endonuclease klasse | Functies | Typische enzymsoorten |
| Type I | 1. Herkenning en modificatie van splitsing. 2. Het kan specifieke DNA-sequenties herkennen en de verteringsplaats ligt oneindig ver van de herkenningsplaats, tot wel duizenden basen. 3. Actie vereist ATP. | EcoB, EcoK, enz. |
| Type II | 1. Heeft alleen de functie om snijwonden te identificeren. 2. De herkenningssequentie is vaak een korte palindroomsequentie (ongeveer 4–8 bp), en de specifieke verteringsplaats van het restrictie-endonuclease is doorgaans de herkende sequentie. 3. Actie vereist Mg2+. 4. Het type restrictie-enzymen dat het meest wordt gebruikt bij moleculair klonen. | HindIII, NotI, enz. |
| Type III | 1. Herkenning en modificatievertering. 2. Overscheidt de herkenningsplaats van de verteringsplaats. 3. Actie vereist ATP. | HinfIII et al. |
| Type IV | 1. Knipt alleen gemethyleerde DNA-sequenties. 2. Er zitten ongeveer 30 bp tussen de herkenningsplaats en de verteringsplaats. | McrA, McrBC, enz. |
Zoals aangegeven in onderstaande Tabel 3, kan het ook worden opgesplitst in drie groepen op basis van de overeenkomsten en verschillen tussen de herkennings- en verteringsplaatsen.
Tabel 3.Vergelijkende analyse van Isoschizomer, Neoschizomer en Isocaudarner
|
| Isoschizomeer | Neoschizomeer | Isocaudarner |
| herkenningssequentie | dezelfde | dezelfde | verschillend |
| spijsverteringsplaatsen | dezelfde | verschillend | dezelfde |
| typische vertegenwoordiger | AgeI en BshTI: herkennen en splitsen beide 5′-A↓CCGGT-3′ | SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) en XmaI(5′-C↓CCGGG-3′) | BamHI (5'-G↓GATCC-3') en BglII (5'-A↓GATCT-3') |
Gezien het feit dat sommige restrictie-endonucleasen op de markt nog steeds een nachtelijke vertering vereisen, en de producten gevoelig zijn voor een onjuiste vertering,
4. Yeasen FuniCut™ Snelle restrictie-endonucleasen
Figuur 2.
4.1 Kenmerken
- Snelle vertering: de vertering kan in 5 tot 15 minuten voltooid zijn, wat vergeleken met conventionele verteringsexperimenten met ruim 1 tot 2 uur kan worden verkort.
- Universele buffer: De multi-enzym splitsingsreactie wordt vereenvoudigd door het feit dat elke combinatie van endonucleasen dezelfde buffer kan gebruiken.
- Effect van enzymvertering: vergelijkbaar met N* en geschikt voor zijn buffer.
- Directe elektroforese vereenvoudigt het proces doordat het een rode kleurbuffer biedt en de verteringsproducten direct voor elektroforese kunnen worden aangevoerd.
- Nauwkeurige vertering: Zelfs bij vertering gedurende de nacht is er zeer weinig steractiviteit.
4.2 Tentoonstelling van de prestatie
4.2.1 In FuniCut™ Buffer vindt enkele, dubbele en driedubbele vertering plaats in 5 minuten.
Figuur 3. Enkele, dubbele en driedubbele vertering met behulp van de FuniCut™ Buffer kan doorgaans binnen 5 minuten op zijn, bijvoorbeeld de drievoudige vertering met EcoRI+KpnI+SmaI.
4.2.2 De impact van de enzymvertering is vergelijkbaar met die van N* en T*, en het werkt goed met hun buffers.
Figuur 4. Vergeleken met soortgelijke N*, T* goederen,
4.2.3 Nachtelijke vertering met zeer lage steractiviteit
Figuur 5. Gebruik de snelle endonucleasen HindIII, NheI, PstI, XbaI en XhoI uit de
4.2.4 Zeer redundant en in staat om overtollig substraat te verwerken.
Afbeelding 6. Met behulp van de FuniCut™ snelle restrictie-endonucleasen EcoR I, Eag I, XbaI en Sac I werden respectievelijk 1 μg en 1,5 μg plasmide als substraat gebruikt en gedurende 5 minuten verteerd. De verteerde producten werden onderworpen aan agarosegelelektroforese.
Tabel 4.Producten en reactiebuffercompatibiliteit
| Productnaam | Kat# | Herkenningssequentie | Temperatuur | Thermische deactiveringstemperatuur |
| T*-buffer | N*-buffer | Ta*-buffer | Beschermde basis (bp) | Reacties |
| FuniCut™ AscI (navragen) | 15001ES50 | GG/CGCGCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| FuniCut™ AvrII (navragen) | 15002ES25 | C/CTAGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| FuniCut™ BamHI (navragen) | 15003ES76 | G/GATCC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| FuniCut™ BclI (navragen) | 15004ES62 | T/GATCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 125T |
| FuniCut™ BsaI (navragen) | 15005ES50 | GGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Niet | 50T |
| FuniCut™ BstEII (navragen) | 15006ES60 | G/GTNACC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Niet | 100T |
| FuniCut™ ClaI (navragen) | 15007ES50 | BIJ/CGAT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| FuniCut™ DpnII (navragen) | 15008ES50 | /GATC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 75 | Niet | 50T |
| FuniCut™ EagI (navragen) | 15009ES25 | C/GGCCG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ EcoRI (navragen) | 15010ES78 | G/AATTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 600T |
| FuniCut™ EcoRV (navragen) | 15011ES70 | GAT/ATC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 200T |
| FuniCut™ HindIII (navragen) | 15012ES76 | A/AGCTT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 500T |
| FuniCut™ HpaI (navragen) | 15013ES50 | GTT/AAC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 1 | 50T |
| FuniCut™ KpnI (navragen) | 15015ES70 | GGTAC/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 200T |
| FuniCut™ MluI (navragen) | 15016ES60 | Een/CGCGT | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| FuniCut™ NcoI (navragen) | 15018ES30 | C/CATGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| FuniCut™ NdeI (navragen) | 15019ES70 | CA/TATG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| FuniCut™ NheI (navragen) | 15020ES30 | G/CTAGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 30T |
| FuniCut™ NietI (navragen) | 15021ES50 | GC/GGCCGC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| FuniCut™ PstI (navragen) | 15022ES76 | CTGCA/G | 37 | Nee | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| FuniCut™ Zakje (navragen) | 15023ES60 | GAGCT/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 100T |
| FuniCut™ SalI (navragen) | 15024ES70 | G/TCGAC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 200T |
| FuniCut™ SbfI (navragen) | 15025ES25 | CCTGCA/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ Klein (navragen) | 15027ES60 | CCC/GGG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| FuniCut™ Spel (navragen) | 15028ES50 | A/CTAGT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
| FuniCut™ SphI (navragen) | 15029ES50 | GCATG/C | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 50T |
| FuniCut™ SspI (navragen) | 15030ES56 | AAT/ATT | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 60T |
| FuniCut™-studie (navragen) | 15031ES60 | AGG/CCT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 1 | 100T |
| FuniCut™ TaqI (navragen) | 15032ES70 | T/CGA | 65 | Nee | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ XbaI (navragen) | 15033ES76 | T/CTAGA | 37 | 80 | 100 | 50 | 100 | 100 | 2 | 500T |
| FuniCut™ XhoI (navragen) | 15034ES76 | C/TCGAG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 500T |
| FuniCut™ FspI (navragen) | 15036ES50 | TGC/GCA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 50T |
| FuniCut™ HinfI (navragen) | 15038ES76 | G/ANTC | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 500T |
| FuniCut™ Wat is een PALI (navragen) | 15039ES70 | G/TGCAC | 37 | 80 | 100 | 75 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ Nr. I (navragen) | 15040ES50 | TCG/CGA | 37 | Nee | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 50T |
| FuniCut™ PacI (navragen) | 15041ES25 | TTAAT/TAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 25T |
| FuniCut™ PvuII (navragen) | 15042ES70 | CAG/CTG | 37 | Nee | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 200T |
| FuniCut™ SacII (navragen) | 15043ES50 | CCGC/GG | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 4 | 50T |
| FuniCut™ NsiI (navragen) | 15044ES25 | ATGCA/T | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 3 | 25T |
| FuniCut™ Esp3I (BsmBI) (navragen) | 15048ES30 | CGTCTC(1/5) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 5 | 30T |
| FuniCut™ BglII (navragen) | 15049ES60 | A/GATCT | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 50 | 2 | 100T |
| FuniCut™ BstBI (navragen) | 15050ES60 | TT/CGAA | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | Niet | 100T |
| FuniCut™ MnlI (navragen) | 15051ES50 | CCTC (7/6) | 37 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 2 | 50T |
CpG: Beïnvloed door CpG-methylering.
EK: Beïnvloed door EcoKI-methylering.
EB: Beïnvloed door EcoBI-methylering.
Dcm: Beïnvloed door Dcm-methylering.
Dam: Beïnvloed door Dam-methylering.