Deoxyribonuclease I (DNase I) is een endonuclease, de toepassing ervan is niet alleen om RNA-integriteit te behouden, maar ook voor DNA-voetafdrukanalyse, generatie van willekeurige DNA-bibliotheken, vermindering van kleverigheid in cellysaten of proteïne-extracten, enz. Kortom, DNase I kan worden gebruikt in bijna elke toepassing die enzymsplitsingen van DNA vereist. Hieronder volgt een gedetailleerde introductie tot DNase I en de specifieke toepassing ervan.

1. Wat is DNase I?
2. DNase I voor de bereiding van DNA-vrije RNA-extractie
3. DNase I voor in vitro transcriptie om template DNA te verwijderen
4. DNase I voor rRNA-verwijdering
5. DNase I voor DNA-labeling
6. Andere toepassingen
7. DNase I productselectiegids

1. Wat is DNase I?

Desoxyribonuclease I (DNase I) is een niet-specifieke endonuclease die enkel- of dubbelstrengs DNA kan verteren, dat aanwezig is in verschillende weefsels en lichaamsvloeistoffen. Het kan fosfodiësterbindingen hydrolyseren om mono- en oligodeoxynucleotiden te produceren die een 5'-fosfaatgroep en een 3'-OH-groep bevatten. Het optimale werk-pH-bereik van DNase I is 7-8, de activiteit ervan is afhankelijk van Ca2+ en kan worden geactiveerd door divalente metaalionen zoals Mn2+, Mg2+, Zn2+, enz. In aanwezigheid van Mg2+ knipt DNase I willekeurig elke plaats van dubbelstrengs DNA; in aanwezigheid van Mn2+ kan DNase I dubbelstrengs DNA op dezelfde plaats knippen om een ​​stomp uiteinde of een 1-2 nucleotide kleverige uiteinden overhang te vormen.

Figuur 1. Schematisch diagram van de splitsing van dsDNA door DNase I in aanwezigheid van Mg2+ en Mn2+.

Hoewel DNase I-splitsingen over het algemeen worden beschouwd als niet-specifieke splitsingen, is het waarschijnlijker dat DNase I inwerkt op bepaalde sequentiefragmenten, zoals de minor groove-regio, en is het gevoeliger voor splitsingen van purine-pyrimidinesequenties. Wanneer DNase I echter inwerkt op heterogeen dsDNA, worden alle vier de basen gesplitst en zal het effect op een specifieke base niet meer dan 3 keer groter zijn dan dat van andere basen.

2. DNase I voor de bereiding van DNA-vrije RNA-extractie

Bij biologische experimenten is de eerste stap het voorbereiden van nucleïnezuur om verschillende functies van RNA te bestuderen. Omdat DNA en RNA echter vaak samen worden vrijgegeven tijdens het cellyseproces, kan de interferentie in de twee niet worden vermeden, ongeacht welke extractieoplossing wordt gebruikt. Daarom moeten specifieke enzymen worden gebruikt om de interferentie te verwijderen. Voor hoogwaardige RNA-extractie wordt DNase I gebruikt om resterend DNA uit het monster te verwijderen.

DNase I kan dubbelstrengs en enkelstrengs DNA afbreken tot oligonucleotiden en enkelvoudige nucleotiden, en het DNA in het RNA-preparaatproduct kan effectief worden afgebroken. DNase I wordt vervolgens geïnactiveerd door verhitting met een stopbuffer. Tijdens het verhittingsproces kan de haarspeldstructuur van het RNA-molecuul worden geopend, wat de directe toegang van het RNA tot het reverse transcriptieproces vergemakkelijkt.
De kwaliteit van RNA zal de experimentele gegevens in grote mate direct beïnvloeden. Over het algemeen kunnen gDNA-residuen niet volledig worden vermeden tijdens RNA-extractie, daarom wordt over het algemeen aanbevolen om RNA-monsters te behandelen met DNase I om resterend gDNA te verteren voordat u downstream-toepassingen uitdaagt (bijv. mRNA-expressieanalyse, transcriptoomanalyse, enz.). De stap van het verteren van gDNA kan worden uitgevoerd tijdens RNA-extractie, na RNA-extractie of vóór RNA-reverse transcriptie.Volgens de productpositionering worden de producten geleverd door Yeasen zijn als volgt:

Tabel 1: Lijst met producten gerelateerd aan DNA-verwijdering van RNA-extractie of vóór reverse transcriptie

3. DNase I voor in vitro transcriptie om template DNA te verwijderen

In vitro transcriptie (IVT) gebruikt voornamelijk DNA als template, plus bijbehorende substraten en buffers om RNA te verkrijgen via in vitro transcriptie. Bij in vitro transcriptie-experimenten worden RNA-polymerasen zoals T7, T3 en SP6 vaak gebruikt voor RNA-synthese. Het gesynthetiseerde RNA kan DNA-residuen bevatten. Het verwijderen van de DNA-residuen is gunstig voor de ontwikkeling van downstream experimenten. Bijvoorbeeld, in de mRNA-vaccinontwikkelingsfase is het verwijderen van residuen een cruciale stap, wat de moeilijkheid van downstream zuivering kan verminderen en de zuiverheid van het product kan verhogen. De DNA-template wordt doorgaans verwijderd met behulp van Recombinant DNase I (RNase-vrij).Volgens het mRNA-syntheseproces worden de producten geleverd door Yeasen zijn als volgt: