Naarmate medisch onderzoek vordert, is gerichte therapie volwassener geworden. Het uitgangspunt van gerichte behandeling is om genetische tests uit te voeren op de moleculaire doelwitten van medicijnen om genmutaties te identificeren die erfelijke aandoeningen of maligniteiten veroorzaken. ARMS-PCR is een nieuwe methode op basis van PCR die talrijke DNA-puntmutaties kan detecteren. Momenteel is het een van de meest essentiële en wijdverbreide methoden voor de op maat gemaakte genetische identificatie van kankers. De voordelen van het therapeutische gebruik ervan zijn goed erkend door veldexperts.

1. Hoe werkt allelspecifieke PCR?
2. Hoe kan de specificiteit van ARMS worden verbeterd?
3. Wat zijn de kenmerken van de producten die door Yeasen?
4. Wat zijn productprestatiegegevens?
5. Hoe bestellen mensen producten?

1. Hoe werkt allelspecifieke PCR?

ARMS-PCR is Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), ook bekend als Allele-Specific PCR (AS-PCR). De allelspecifieke extensie wordt gereguleerd om het wildtype-allel en het mutante wildtype-gen te identificeren, en de fluorescentiesignaalwaarde wordt gemeten met behulp van de Taqman-sondetechniek.
ARMS PCR-primers zijn ontworpen met verschillende nucleotiden aan het 3'-uiteinde van de twee upstream primers van het allel, en de twee primers zijn respectievelijk specifiek voor het wildtype en het mutanttype. Tijdens amplificatie kunnen upstream primers die niet volledig overeenkomen met de template geen complementaire basenparen vormen, wat resulteert in mismatches, gehinderde extensie en het onvermogen om PCR-producten te genereren, terwijl primersystemen die overeenkomen met de template de overeenkomstige PCR-producten kunnen amplificeren. De fluorofoor op de Taqman-sonde kan een fluorescerend signaal uitzenden dat kan worden gedetecteerd door het apparaat, en het genotype kan worden gevalideerd door de fluorescentiegegevens te evalueren.
ARMS-technologie heeft een hoge gevoeligheid, de detectielimiet kan 100 kopieën/ml bereiken en de detectielimiet voor tumorweefsel kan een mutatiepercentage van 0,5% bereiken. Bovendien is ARMS tijdrovend en goedkoop, en de resultaten zijn intuïtief en gemakkelijk te beoordelen. Dit komt omdat ARMS gecombineerd met qPCR of elektroforesetechnologie slechts één PCR-reactie vereist, wat minder tijd kost. Alleen upstream primers hoeven te worden geoptimaliseerd voor ARMS-technologie, die lagere kosten en intuïtieve resultaten heeft in vergelijking met realtime PCR-technologie met MGB-sondes. Omdat het grootste deel van het DNA dat wordt geëxtraheerd uit in paraffine ingebedde weefselmonsters gefragmenteerd is, kunnen er geen nauwkeurige detectieresultaten worden verkregen. De ARMS-methode is ontworpen om de lengte van het doelproduct te minimaliseren, waardoor deze moeilijkheid in in paraffine ingebed weefsel wordt aangepakt. Tegelijkertijd realiseert ARMS gecombineerd met het PCR-platform een ​​gesloten-buiswerking, die eenvoudig te bedienen is en geen nabewerking van het product vereist, waardoor de contaminatie van amplificatieproducten zoveel mogelijk wordt vermeden.
Theoretisch gezien moet Taq DNA polymerase volledig complementair zijn aan de resterende template aan het 3' uiteinde van de primer om efficiënte polymerisatie uit te voeren. De stringentie van Taq DNA wordt echter beïnvloed door verschillende factoren. In sommige gevallen kan een verlenging doorgaan, zelfs als de 3' terminale base van de primer niet complementair is aan de template. Als er maar één base mismatch is aan het 3' uiteinde, kunnen de primers mismatched en verlengd worden, maar de verlengingsefficiëntie is laag. Verschillende dislocaties van het 3' uiteinde hebben verschillende verlengingsefficiënties. Als andere mismatched basen worden geïntroduceerd aan het 3' uiteinde, is het aantal mismatches te groot en kan het 3' uiteinde niet worden verlengd na een bepaald niveau.Daarom kan slechts één basemismatch aan het 3'-uiteinde van de primer de twee allelen niet adequaat onderscheiden, wat resulteert in vals-positieve resultaten.

2. Hoe kan de specificiteit van ARMS worden verbeterd?

De focus van het verbeteren van ARMS-specificiteit is het verbeteren van primer-extensiespecificiteit. Een niet-passende base kan worden geïntroduceerd op de 2e of 3e base vanaf het 3'-uiteinde. De niet-passende basen werken samen met de niet-passende basen op het 3'-uiteinde, en in de template die niet complementair is aan het 3'-uiteinde, wordt de primer-amplificatieproductsnelheid verlaagd. Terwijl primers normaal gesproken amplificeren in templates die complementair zijn aan hun 3'-uiteinden, hangt het type niet-passende basen van primers af van het type base-mismatch op het 3'-uiteinde.
Nadat de specifieke primers voor ARMS zijn ontworpen, is een paar TaqMan-probes voor allelspecifieke fluorescentieresonantie-energieoverdracht vereist. TaqMan-probes hebben twee fluorescerende kleurstoffen, het 5'-uiteinde is een fluorescerend gen en het 3'-uiteinde heeft een algemeen fluorescentie-quenchinggen. In een complete probe liggen het quenchergen en het fluorogene gen ruimtelijk heel dicht bij elkaar, wat resulteert in fluorescentie-quenching. Onder normale omstandigheden kan de fluorescentie die wordt uitgezonden door de fluorofoor aan het 5'-uiteinde niet worden gedetecteerd en kan alleen de achtergrondfluorescentie van de quencher aan het 3'-uiteinde worden gedetecteerd. In het proces van doelgenamplificatie zullen zowel PCR-primers als fluorescent gelabelde probes complementair zijn aan de doelsequentie tijdens de-OR. Wanneer het Taq-enzym een ​​probe tegenkomt die stabiel is gebonden aan de template bij het verlengen van de templatestreng, zal de 5'-3'-exonuclease van het Taq-enzym de specifieke probe die is gebonden aan de template afbreken. De fluorofoor op de probe wordt gescheiden door fysieke ruimte, het quenching effect verdwijnt en fluorescentie wordt uitgezonden. Mismatches tussen zwak fluorescerende probes en doelsequenties zullen de hoeveelheid vrijgekomen fluorescentie verminderen.

Figuur 1 Fundamenteel concept van ARMS-PCR

3. Wat zijn de kenmerken van de producten die door Yeasen?

Yeasen Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix is ​​een kit gebaseerd op het amplificatieblokconcept dat efficiënte ARMS-PCR-gemedieerde genotypering mogelijk maakt.

👍Hoge selectiviteit: in staat om meerdere genmutaties te identificeren;
👍Hoge gevoeligheid: mutantprimers kunnen mutaties detecteren bij concentraties van slechts 0,5% in 10 ng/L DNA;
👍Eenvoudig te lezen: De resultaten zijn duidelijk en objectief beoordeeld, en het is eenvoudig en ongecompliceerd;
👍Eenvoudig te bedienen: het is compatibel met een reeks PCR-apparatuur, de werkingsmodus is gestandaardiseerd en de detectie aan boord kan binnen 90 minuten worden voltooid.

4. Wat zijn productprestatiegegevens?

4.1 Superieure impact op productblokkering

Experiment: 5L template-input, 10ng/L wildtype template en equivalente hoeveelheden mutant plasmide werden versterkt met behulp van mutante primers
Locatie: KRASG13D (38G>A)
Rood: 13755; Blauw: Concurrenten

Figuur 2 laat zien dat wildtype primers zowel wildtype als mutant templates versterken. Volgens de amplificatiecurve heeft de wildtype template geen piek of is het verschil in Ct-waarde tussen de wildtype en de mutant 6-8, waardoor de wildtype en mutant genen effectief kunnen worden onderscheiden.

4.2 Het detectiepercentage van het product kan 0,05% bedragen

Experiment 1: Zelfmengende standaardbereidingstechniek (50%): 50 μL 10 ng/μL wildtype DNA en 50 μL 3X103 kopieën van mutant plasmide.
Locatie: KRASG13D(38G>A)

Figuur 3. Volgens de amplificatiecurve blijft het product effectief werken bij een concentratie van 0,05%

Experiment 2: De gekochte 5% standaard (50 ng/μL) werd verdund met bibliotheekverdunningsmiddel tot 10 ng/μL en vervolgens verder verdund met 10 ng/μL 293 g DNA tot 0,1% en 0,05%.
Locatie: L858R
Rood: 13755; Blauw: Concurrenten

Figuur 4: Volgens de amplificatiecurve kan de detectiegraad van loci tegen een wildtype gDNA-achtergrond van 10 ng/μL oplopen tot 0,05%. Vervolgens blijkt uit validatie volgens commerciële normen dat onze producten een uitstekende detectiegraad hebben.

4.3 Uitstekende productstabiliteit

De versterkende en blokkerende werking van het product wordt niet beïnvloed door 10 cycli van invriezen en ontdooien.
Experiment: rood: -20℃; groen: echt vriezen-ontdooien 5 keer; blauw: echt vriezen-ontdooien 8 keer; paars: echt vriezen-ontdooien 10 keer.
Locatie: L858R

Figuur 5 laat zien dat herhaaldelijk invriezen en ontdooien van reagens 13755 tien keer geen invloed heeft op de amplificatie- en blokkeringseigenschappen ervan.

De versterkende en blokkerende effecten worden niet beïnvloed door een temperatuur van 37 °C gedurende 7 dagen.
Experiment: Rood: -20°C; Groen en paars: 37°C gedurende 7 dagen.
Locatie: L858R

Figuur 6 laat zien dat zeven dagen bij 37°C geen invloed hebben op de amplificatie en blokkerende werking van 13755-reagens.

5. Hoe bestellen mensen producten?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., opgericht in 2014, is een hightechbedrijf dat zich bezighoudt met R&D en productie van grondstoffen voor enzymtools en antigeenantilichamen. De producten omvatten moleculaire diagnostische enzymen, eiwitten en antilichamen die worden gebruikt in farmaceutische producten, voedselveiligheidstesten, fokkerij, justitie en andere industrieën. Wij streven ernaar om klanten in de life sciences-sector te voorzien van hoogwaardige producten en diensten. De producten die Yeasen kunnen de volgende zijn:

Tabel 1: Producten geleverd door Yeasen