dNTP staat voor gepatroneerd ribonucleotide trifosfaat dat wordt gebruikt in PCR en dat een groeiende DNA-streng kan versterken. Met andere woorden, dNTP's in PCR vormen complementaire DNA-strengen via waterstofbruggen en de groeiende DNA-strengen worden uitgebreid met behulp van Taq DNA-polymerase. Wat is de specifieke toepassing van dNTP in PCR? Wat zijn de eigenschappen die dNTP's met een hoge zuiverheid moeten hebben?

1. Wat zijn dNTP's?
2. Wat is de concentratie dNTP in PCR?
3. Wat zijn de vereiste eigenschappen van dNTP met hoge zuiverheid?
4. Gerelateerde producten en prestaties

1. Wat zijn dNTP's?

Deoxynucleoside trifosfaten (dNTP's) zijn nucleoside trifosfaten die deoxyribose bevatten, een keten van nucleotiden bestaande uit ribose, een base en een fosfaat. dNTP's zijn de essentiële bouwstenen van nucleïnezuurmoleculen en als zodanig noodzakelijke componenten van PCR-mixen, aangezien er geen nieuw versterkt DNA zonder hen gegenereerd zou kunnen worden. De vier individuele deoxynucleotiden die een DNA-sequentie vormen, zijn onder andere deoxyadenosine trifosfaat (dATP), deoxythymidine trifosfaat (dTTP), deoxycytidine trifosfaat (dCTP) en deoxyguanosine trifosfaat (dGTP). Daarnaast is de kwaliteit van dNTP's ook van cruciaal belang voor het succes van veel procedures zoals PCR, cDNA-synthese, qPCR, sequentiebepaling, klonen en DNA-labeling.

Er zijn vier soorten dNTP, of deoxynucleotide trifosfaat, die elk een andere DNA-base gebruiken: adenine (dATP), cytosine (dCTP), guanine (dGTP) en thymine (dTTP). Het gebruik van dNTP tijdens de extensiefase zorgt voor enkele basen die klaar zijn om in DNA te gaan en het te verdubbelen, als bouwstenen. Omdat het doel van de techniek is om nieuw DNA te synthetiseren, levert dNTP nucleotiden aan de "unzipped" streng met behulp van de template van een enkele kant. Dit verandert een enkele streng DNA in twee, en kan exponentieel doorgaan zolang er reagentia aanwezig blijven tot de laatste hold-fase.

2. Wat is de concentratie dNTP in PCR?

PCR is een in vitro techniek van DNA-synthese die wordt uitgevoerd om meerdere kopieën van een DNA-fragment van belang te genereren, zodat het kan worden gevisualiseerd onder gelelektroforese. Het doel van PCR is om een ​​groot aantal kopieën van DNA te maken voor verschillende downstream-toepassingen in DNA-sequencing of DNA-microarrays. De componenten ervan omvatten DNA-sjablonen, primers, buffers en Taq DNA-polymerase dNTP. Om het mechanisme van PCR te begrijpen, is het noodzakelijk om het belang en het principe van de gebruikte componenten te begrijpen. dNTP is een van de belangrijkste componenten van PCR. De functie van dNTP's in PCR is om de groeiende DNA-streng te versterken met behulp van Taq DNA-polymerase en om te combineren met de complementaire DNA-streng door middel van waterstofbindingen.

Het PCR-proces is verdeeld in drie temperatuurafhankelijke stappen: denaturatie, annealing en extensie. Tijdens de denaturatiestap wordt dubbelstrengs DNA gedenatureerd tot enkelstrengs DNA. Tijdens de annealingstap binden de primers op de exacte locatie van hun complementaire sequentie en tijdens de extensiestap voegt Taq DNA-polymerase dNTP's toe aan de groeiende DNA-streng. Zodra de strengen zijn geopend en de primers zich binden aan het enkelstrengs DNA, begint Taq DNA-polymerase met zijn katalytische activiteit. In de volgende stap begint de toevoeging van dNTP's, die zich met minder affiniteit aan het P-DNA-complex binden als de exacte complementaire nucleotide aanwezig is. Kort nadat Taq DNA-polymerase vasthoudt, vinden er waterstofbindingsinteracties plaats tussen complementaire basen en dNTP's. Hier is het niet de hele nucleotide aan het begin, maar de base (stikstofbase) op de dNTP die beslist of deze zich bindt of niet.Ten eerste, als het een complementaire base (A voor T, G voor C) op de template ssDNA vindt, zal het een waterstofbinding tussen hen vormen. Drie waterstofbindingen tussen C en G en twee waterstofbindingen tussen A en T worden gemaakt. Zodra de waterstofbinding is gevormd, voldoet Taq DNA polymerase aan de opname van de dNTP in de groeiende DNA streng door een fosfodiesterbinding te vormen. Nu, nadat de fosfodiesterbinding is gevormd, gaat Taq DNA polymerase een stap verder door nieuwe dNTP's toe te voegen. Een fosfodiesterbinding wordt gevormd tussen de 3'OH van de primer en de 5'P van de dNTP. Na waterstofbinding katalyseert Taq DNA polymerase de reactie door gamma- en bèta-fosfaten uit de trifosfaten van dNTP's te verwijderen. Nadat de reactie is voltooid, worden twee pyrofosfaten (PPi) vrijgegeven. Maar de exacte kinetiek van dNTP's en Taq polymerase interactie in PCR reacties blijft onbekend.

Deze vier nucleotiden worden doorgaans in equimolaire hoeveelheden aan de PCR-reactie toegevoegd voor optimale base-incorporatie. In bepaalde situaties, zoals willekeurige mutagenese door PCR, worden echter opzettelijk ongebalanceerde dNTP-concentraties toegevoegd om een ​​hogere mate van misincorporatie door een niet-correcte DNA-polymerase te bevorderen. De factor die de minimale dNTP-concentratie bepaalt, is de DNA-lengte en -samenstelling van de doelsequentie. In de PCR-reactie is dNTP over het algemeen 50-200 μmol/L. Wanneer de uiteindelijke dNTP-concentratie groter is dan 50 mmol/L, kan het de activiteit van Taq DNA-polymerase remmen. De concentraties van de vier dNTP's moeten gelijk zijn om misincorporatie tijdens amplificatie te verminderen vanwege een gebrek aan één dNTP.

Bij gangbare PCR-toepassingen is de aanbevolen eindconcentratie van elke dNTP doorgaans 0,2 mM. Hogere concentraties kunnen in sommige gevallen nuttig zijn, vooral in de aanwezigheid van hoge concentraties Mg.²⁺, als Mg²⁺ bindt zich aan dNTP's en vermindert hun opnamesnelheid, waardoor de niet-specifieke snelheid toeneemt. dNTP bevat fosfaat, dat zich kan binden met Mg²⁺ om de concentratie van vrij Mg te verminderen²⁺, dus de verandering in de concentratie zal de effectieve concentratie van Mg beïnvloeden²⁺Onder omstandigheden met een hoge concentratie DNA en dNTP, de Mg²⁺ concentratie moet dienovereenkomstig worden aangepast. Ook leidt de schaarste aan dNTP's tot onvolledige PCR-producten. Echter, dNTP's die de optimale concentraties overschrijden, kunnen PCR remmen. Voor efficiënte incorporatie door DNA-polymerase moeten vrije dNTP's in de reactie aanwezig zijn in een concentratie van niet minder dan 0,01-0,015 mM.

3. Wat zijn de vereiste eigenschappen van dNTP met hoge zuiverheid?

Sinds de ontdekking is de polymerasekettingreactie het ongeëvenaarde hulpmiddel in moleculair genetisch onderzoek. dNTP wordt gebruikt in PCR om de groeiende DNA-streng te vergroten. Zelfs als de kwaliteit van dNTP in het systeem slecht is, zal het een negatieve impact hebben op de eigenschappen van het eindproduct. YeasenDe zeer zuivere dNTP is geschikt voor allerlei zeer gevoelige en reproduceerbare DNA-synthesetoepassingen.

Yeasen biedt kant-en-klare GMP-grade nucleotiden, sets en mixen, geleverd als natriumzouten in gezuiverd water bij pH 7,0. Het productieproces elimineert onzuiverheden en PCR-specifieke remmers, en de dNTP's worden speciaal vervaardigd voor moleculair biologische toepassingen. De dNTP's worden gezuiverd met preparatieve HPLC en bezitten ten minste 99% zuiverheid. Ze kunnen worden gebruikt in PCR-, RT-qPCR-, LAMP-, DNA-labeling- en DNA-sequentieprocessen.
Strenge controlenormen en state-of-the-art technologie zorgen voor de beste kwaliteit van het product. Elke partij dNTP wordt getest op verschillende residuen (bacterieel DNA, menselijk DNA, DNase, RNase, endonuclease).Het product is stabiel van batch tot batch en geschikt voor allerlei zeer gevoelige en reproduceerbare DNA-synthesetoepassingen.

4. Gerelateerde producten en prestaties

4.1 Geen bacterieel DNA-residu

Figuur 1. De detectieresultaten laten zien dat de dNTP's geen bacteriële genoomresten hebben.

4.2 Geen menselijk DNA-residu

Figuur 2. De detectieresultaten laten zien dat dNTP's geen resten van het menselijk genoom hebben.

4.3 Geen DNase-, RNase- en endonuclease-verontreiniging

Figuur 3. De detectieresultaten laten zien dat dNTP's geen DNase, RNase en endonuclease hebben.

4.4 PCR-amplificatie (20 kb DNA)

Figuur 4. Het PCR-amplificatieresultaat is het verwachte 20 kb-product.

4.5 Productinformatie

De producten die door Yeasen zijn als volgt.

Tabel 1.Productinformatie