Met de snelle ontwikkeling van biotechnologie heeft mRNA-therapie, als opkomende behandelmethode, veel aandacht getrokken vanwege de sterke programmeerbaarheid en snelle responssnelheid. Op het gebied van mRNA-vaccins en gentherapie is het efficiënt synthetiseren van hoogwaardig mRNA een belangrijke stap in het bereiken van therapeutische doelen. Tijdens dit proces speelt T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) een essentiële rol, het kan de in vitro-synthese van mRNA efficiënt katalyseren.
Hoewel T7 RNAP een cruciale rol speelt in de synthese van mRNA, produceert het in de praktijk vaak dubbelstrengs RNA (dsRNA) als bijproduct. dsRNA is een van de kenmerken van veel virussen en wordt daarom gemakkelijk herkend door intracellulaire dsRNA-bindende eiwitten, waardoor aangeboren immuunreacties en ontstekingsreacties worden geactiveerd. Dit betekent dat als mRNA-formuleringen een hoger niveau van dsRNA bevatten, dit kan leiden tot onnodige immuunactivatie, wat de therapeutische werkzaamheid kan beïnvloeden of ernstige bijwerkingen kan veroorzaken. Overmatig dsRNA kan ook interfereren met de normale functie van mRNA, inclusief translatie-efficiëntie en mRNA-stabiliteit, wat indirect de effectiviteit van mRNA-therapie beïnvloedt.
Figuur 1: De impact van dsRNA-bijproducten en de geoptimaliseerde T7 RNAP-reactie.
Daarom is het ontwikkelen en toepassen van effectieve methoden om de generatie van dsRNA te verminderen een cruciaal onderdeel van de ontwikkeling van mRNA-technologie. Onderzoekers hebben verschillende strategieën ontwikkeld, waaronder het gebruik van verbeterde T7 RNA-polymerasen, modificatienucleotiden, optimalisatie van IVT-transcriptiebuffers en downstream-zuiveringsprocessen.
Productgegevens
Opbrengst: meer dan 9 mg/ml
dsRNA-gehalte: het dsRNA-gehalte is aanzienlijk verminderd met ten minste 10 keer
Capping-efficiëntie: meer dan 99%
Lage dsRNA T7 RNA-polymerase Screeningproces:
1) de constructie van een willekeurige bibliotheek en FADS high-throughput screeningmethode, een willekeurige mutatiebibliotheek van meer dan 10^6 werd vertoond.
2) semi-rationeel ontwerp en microplate-technologie werden gebruikt om een site-verzadigde bibliotheek te screenen. Beide methoden leverden lage dsRNA T7 RNA-polymerasemutanten op. Gezien het dsRNA-gehalte en tegelijkertijd ervoor zorgend dat andere indicatoren niet worden verminderd (zoals integriteit/capping-efficiëntie/opbrengst, enz.), Er werden verschillende mutanten geselecteerd en één ervan, genaamd CleaScrip™ T7, werd gebruikt voor commerciële toepassingen.
Productgegevens
In verschillende toepassingsscenario's met verschillende lengtes heeft de lage dsRNA T7 RNA-polymerase een zeer significante afname laten zien vergeleken met zowel WT T7 als concurrerende producten, terwijl de opbrengst en integriteit niet worden verminderd.
| Fragmentlengte | T7 RNA-pol | Opbrengst(mg/ml） |
Integriteit(%） | dsRNA-inhoud (ng dsRNA geproduceerd per 1ug RNA) |
| 4K | T7-WT | 12.4 | 88.3 | 0,4273 |
| CleaScrip™ T7 | 12.1 | 89.9 | 0,0129 | |
| Bedrijf A | 11.0 | 87.8 | 0,0323 | |
| 9K | T7-WT | 9.5 | 81.9 | 2.9180 |
| CleaScrip™ T7 | 9.0 | 82.0 | 0,0379 | |
| Bedrijf A | 7.2 | 78.7 | 0,1805 |
Gebruik makend van een cap-concentratie van 2,5 mM, kan nog steeds een uitstekende capping-efficiëntie worden bereikt over verschillende fragmentlengtes vergeleken met WT. Bovendien worden ook superieure eiwitexpressieprestaties waargenomen op cellulair niveau.
| Cap analoge ingang（mmm） | Capping-efficiëntie（%）4K | |
| GEW | Laag dsRNA | |
| 10 | 100 | 100 |
| 5 | 100 | 100 |
| 2.5 | 100 | 100 |
Er is patent aangevraagd in de Verenigde Staten.
Productinformatie
| Productnaam | Catalogusnummer | Specificatie | Volume |
| SchrijfscriptTM T7 RNA-polymerase (laag dsRNA, 250 U/μL) | 10628ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 ml/100 ml |
| SchrijfscriptTM T7 RNA Polymerase GMP-klasse (laag dsRNA, 250 U/μL) | 10629ES | 100 /2500 /25.000KU | 400 μL/10 ml/100 ml |