T7 High Yield RNA -synthesekit vergemakkelijkt de efficiënte synthese van transcripten met verschillende lengtes

De Dbeschrijving van T7 High Yield RNA Synthesis Kit

De T7 High Yield RNA Synthesis Kit optimaliseert het transcriptiereactiesysteem. De kit kan de enkelstrengs RNA efficiënt synthetiseren door T7 RNA-polymerase te gebruiken, de ikge-ineariseerd dubbelstrengs DNA met de T7-promotorsequentie als template, NTP's als substraten om de DNA-sequentie stroomafwaarts van de promotor te transcriberen. Tijdens transcriptie kunnen gemodificeerde nucleotiden Ook worden toegevoegd als substraten voor de productie van biotine of kleurstof-gelabeld RNA.

Deze kit kan synthetiseren beide lange transcripten en korte transcripten, RNA kan worden geproduceerd in 100-200 μg met 1 μg DNA-template-input. Het RNA dat door transcriptie wordt gesynthetiseerd, kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, zoals RNA-structuur- en functieonderzoekHes, RNase-bescherming, probe-hybridisatie, RNAi, micro-injectie en in vitro-translatie.

Syntheseprincipe

Figuur 1: In vitro RNA-transcriptieproces

Productvoordelen

Hoge opbrengst: kan tot 200 μg in 2 uur produceren via een transcriptiereactie

Betere veelzijdigheid: geschikt voor transcriptie van 20nt-10000nt RNA

Uitstekende prestatie: effectief de bijproducten van transcriptie verminderen tijdens het IVT-proces

Meerdere toepassingen: kan worden gebruikt voor gewone, gelabelde en gemodificeerde RNA-synthese

Producteigenschappen

Figuur 2: Opbrengst van transcripten van verschillende lengtes

Figuur 3: Kwaliteit van transcripten van verschillende lengtes

Figuur 4: Uitdrukking van getranscribeerd mRNA in HEK-293 cellen

Let op: Het mRNA is afgedekt met Vaccinia Capping Enzyme(Yeasen(nr. 10614/10615).

Experimentele methoden

Ontdooi-reagentia

    Centrifugeer het T7 RNA Polymerase-mengsel kort en plaats Het op ijs. Ontdooi 10×Transcription Buffer en ribonucleotideS (ATP, CTP, GTP, UTP), meng en centrifugeer tot de bodem van de buis, doe er 10×transcriptiebuffer bij op kamertemperatuur en plaats de 4 soorten ribonucleotiden op ijs.

    B.Assemblage transcriptiereactie bij kamertemperatuur

      Bereid het reactiesysteem voor volgens het volgende systeem:

      Componenten

      Inhoud (µL)

      Eindconcentratie

      RNase-vrije H2O

      Tot 20

      -

      10×Transcriptiebuffer

      2

      1×

      CTP / GTP / ATP / UTP (elk 100 mM)

      2 elk

      10 mM elk

      Sjabloon-DNA

      1 µg

      -

      T7 RNA-polymerase-mix

      2

      -

      Opmerkingen:

      1. De reactie wordt geconfigureerd bij kamertemperatuur. Omdat 10× Transcription Buffer spermidine bevat, kan de hoge concentratie spermidine DNA-templateprecipitatie veroorzaken bij lage temperatuur.
        Voor korte transcripten (<100 nt) kan een template van 2 µg worden gebruikt, waardoor de transcriptietijd wordt verlengd tot 4-8 uur.
        3. Voor lange transcripten (>1000 nt) wordt aanbevolen om gelineariseerde plasmiden te gebruiken als sjablonen voor transcriptie.
        4. Voer de reactie uit in het PCR-instrument met het hete deksel open om verdamping te voorkomen.
        5. Het reactieproduct kan een wit neerslag hebben. Het neerslag is het magnesiumpyrofosfaat dat wordt geproduceerd door de vrije pyrofosfaat- en magnesiumionen in de reactieoplossing die de daaropvolgende experimenten niet beïnvloeden. Als u het wilt verwijderen, kunt u wat EDTA toevoegen. Als de toevoeging van EDTA de daaropvolgende experimenten beïnvloedt, kan de supernatant ook worden teruggewonnen door middel van centrifugatie.
        6. Zorg ervoor dat de reagentia en containers vrij zijn van RNase-verontreiniging.
      C.Incubeer gedurende 2 uur bij 37°C

      Meng de componentenoplossing, centrifugeer kort tot de bodem van de buis en incubeer gedurende 2 uur bij 37°C. Als de transcriptlengte minder dan 100 nt is, verleng dan de reactietijd tot 4-8 uur.

      D.DNase I-behandeling (optioneel)

      Voeg na afloop van de reactie 2 μL DNase I (RNase-vrij) toe aan elk buisje en laat het 15 minuten bij 37°C incuberen om het template-DNA te verwijderen.

      Veelgestelde vragen

      1. Lage transcriptieopbrengst

      De kwaliteit van de template is nauw verbonden met de opbrengst. De opbrengst van de experimentele groep is significant lager dan de controlegroep. De mogelijke redenen zijn:

      • Het experimentele sjabloon bevat remmende componenten;
      • Er is mogelijk iets mis met de sjabloon.

      Suggesties: ① Zuiver de template opnieuw; ② Bepaal de templatekwantificering en de integriteit ervan; ③ Verleng de reactietijd; ④ Verhoog de hoeveelheid template-invoer; ⑤ Gebruik andere promotoren en andere RNA-polymerasen.

      1. Lage opbrengst van korte transcripten

      Korte templatefragmenten kunnen de reactie remmen. Als het transcriptieproduct kleiner is dan 100 nt, en u wilt de opbrengst verhogen, verleng dan de reactietijd tot 4-8 uur of verhoog de hoeveelheid template tot 2 μg.

      1. De RNA-transcriptielengte is groter dan verwacht

      Als de resultaten van de elektroforese aantonen dat de productband groter is dan de verwachte grootte, kunnen de volgende redenen hiervoor gelden: ①Het plasmidesjabloon is mogelijk niet volledig gelineariseerd; ②Het 3'-uiteinde van de sense-streng heeft een opvallende structuur; ③Het RNA heeft een secundaire structuur die niet volledig gedenatureerd is.

      Suggesties: ①Controleer of de template volledig is gelineariseerd en voer indien nodig extra linearisatie uit; ②Selecteer een geschikt restrictie-enzym om 3'-overhangen te voorkomen of gebruik Klenow Fragment/T4 DNA-polymerase om de transcriptie te voltooien voordat u verdergaat; ③Gebruik gedenatureerde gel om RNA-producten te detecteren.

      1. De RNA-transcriptielengte is kleiner dan verwacht

      Als uit de elektroforese blijkt dat de productband kleiner is dan de verwachte grootte, zijn de mogelijke redenen zijn: ①De template bevat een terminatiesequentie die lijkt op de T7 RNA polymerase terminator; ②Het GC-gehalte van Het sjabloon is te hoog.

      Suggesties: ①Verlaag de reactietemperatuur (bijvoorbeeld 30°C). Soms kan het verlagen van de temperatuur bijdragen aan het verlengen van de transcriptielengte, maar het kan verminder de opbrengst. Probeer andere RNA-polymerasen voor transcriptie; ②Als het GC-templategehalte hoog is, voer de reactie dan uit bij 42℃ of voeg SSB toe om de opbrengst en transcriptielengte te vergroten.

      1. Elektroforetische staart van transcriptieproducten

      Staartvorming tijdens elektroforese kan worden veroorzaakt door: ① RNase-verontreiniging tijdens de experimentele uitvoering; ②Het DNA-sjabloon is verontreinigd met RNases.

      Suggesties: ①Gebruik RNase-vrije pipetpunten en EP-buizen, draag wegwerphandschoenen en -maskers van latex en alle reagentia worden bereid met RNase-vrije H2O. ②Zuiver het template-DNA opnieuw.

      Bestelgegevens

      Productnaam

      Catalogusnummer

      Sverfijning

      T7 High Yield RNA-synthesekit

      10623ES

      50/100/500T

      T7 RNA Polymerase GMP-kwaliteit (250 U/μL)

      10625ES

      10KU/100KU/2500KU/25MU

      Pyrofosfatase, anorganisch GMP-kwaliteit (1 U/μL)

      10620ES

      10U/100U/1000U

      Muizen-RNase-remmer van GMP-kwaliteit (40 U/μL)

      10621ES

      10KU/20KU/100KU/1MU

      mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-kwaliteit

      10614ES

      2KU/10KU/100KU

      mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase GMP-klasse

      10612ES

      10KU/50KU/250KU

      Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-klasse

      10611ES

      500/2000/10000 U

      Hieff NGS® mRNA-isolatiemasterkit

      12603ES

      24/96T

      Inquiry