De ontwikkeling en toepassing van mRNA-technologie blijven de aandacht trekken in de afgelopen jaren. mRNA-medicijnen omvatten het inoculeren van mRNA dat antigeenproteïnen codeert in het menselijk lichaam. Door gebruik te maken van het genetische materiaal in menselijke cellen, drukken ze antigeenproteïnen uit en synthetiseren ze. Dit proces induceert en activeert het immuunsysteem van het lichaam via antigeenproteïnen, met als doel ziekten te voorkomen en te behandelen. mRNA-medicijnen hebben voordelen zoals veiligheid, efficiëntie en een korte cyclus. Ze kunnen tegelijkertijd humorale en cellulaire immuniteit induceren en zijn toegepast bij verschillende indicaties, waaronder tumoren, infectieziekten, zeldzame ziekten, hart- en vaatziekten en meer.
Het gehele proces van mRNA-geneesmiddelenontwikkeling kan grofweg worden onderverdeeld in verschillende stappen:
Sequentiebepaling en -ontwerp - mRNA in vitro transcriptie - encapsulatievoorbereiding
De conventioneel De stappen van mRNA in vitro transcriptie (IVT) omvatten:
Plasmide-DNA-extractie en -linearisatie—Plasmide DNA zuivering—In vitro transcriptie (co-transcriptionele capping)—Zuivering—mRNA-voorraadoplossing
De eenpot Het mRNA in vitro transcriptie (IVT) proces omvat:
Plasmide-DNA-extractie en -linearisatie—In vitro transcriptie (co-transcriptionele capping) - Zuivering - mRNA-voorraadoplossing
Momenteel omvatten de meeste bestaande processen één zuiveringsstap voor plasmide-DNA na enzymatische splitsing vóór de IVT-stap.
Procesvoordelen:
- Procesoptimalisatie, vermindering van IVT-stappen voor eenvoudigere bediening.
- Lagere materiaalkosten, waardoor er geen behoefte meer is aan zuivering na de splitsing en kwaliteitsinspectie.
- Behoud van mRNA-kwaliteit en -opbrengst.
Gegevens:
1. Opbrengsten en Integriteit:
Met behulp van de 1 μg gelineariseerde 2K-, 4K- en 9K-plasmiden; het onepotproces kan 150-200 μg mRNA genereren.
| Lengte | Opbrengsten | Integriteit |
| 2K | 200 μg | 94,00% |
| 4K | 185 μg | 92,20% |
| 9K | 150 μg | 87,50% |
Integriteitstesten werden uitgevoerd met behulp van capillaire elektroforese (CE) om de integriteit van fragmenten met lengtes van 2K, 4K en 9K te beoordelen. De integriteit van 2K- en 4K-fragmenten was >92% en de integriteit van 9K-fragmenten was >87%.
2. Detectie van mRNA-capping-efficiëntie
LC-MS werd gebruikt om de capping-efficiëntie van de 2K-sequentie te beoordelen. Hieruit bleek dat de capping-efficiëntie 99,5% bedroeg.
Bovenste afbeelding: HPLC UV-chromatogram
Onderste afbeelding: Gedeconvolueerd moleculair gewichtsspectrum
3. Detectie van mRNA-polyadenylatie-efficiëntie
LC-MS werd gebruikt om de polyadenyleringsefficiëntie van monsters te bepalen. De resultaten waren normaal verdeeld.
Bovenste afbeelding: Vloeistofchromatografie TIC-chromatogram
Onderste afbeelding: Gedeconvolueerd moleculair gewichtsspectrum
4.mRNA-expressie Beoordelen
Transfectie van 293T-cellen met mRNA-producten die zijn gesynthetiseerd met behulp van zowel de conventioneel proces (Links, gelineariseerde plasmiden w(met zuivering) en het one-pot-proces (rechts, gelineariseerde plasmiden zonder zuivering) liet geen verschil zien in de expressie van fluorescentie-eiwitten na 24 uur cultuur.
Bestel Informatie