T7 High Yield RNA-synthesekit optimaliseert het transcriptiereactiesysteem. De kit kan de enkelstrengs RNA efficiënt synthetiseren door T7 RNA-polymerase te gebruiken, het lineaire dubbelstrengs DNA met de T7-promotorsequentie als template, en NTP's als substraat om de DNA-sequentie stroomafwaarts van de promoter te controleren. Tijdens de transcriptie kunnen gemodificeerde nucleotiden aan het substraat worden toegevoegd om biotine of kleurstof-gelabeld RNA te bereiden.

1. Introductie van T7 High Yield RNA Synthesis Kit
2. Principes van in vitro transcriptie
3. Voordelen van Yeasen T7 High Yield RNA-synthesekit
4. Productprestaties
5. Hoe deze kit te gebruiken
6. Veelgestelde vragen
7. Bestelgegevens

1. Introductie van T7 High Yield RNA Synthesis Kit

T7 High Yield RNA Synthesis Kit kan zowel lange transcripten als korte transcripten synthetiseren, en RNA kan worden geproduceerd in 100-200 μg met 1 μg DNA-template-input. Het gesynthetiseerde RNA kan worden gebruikt voor verschillende downstream-toepassingen, zoals RNA-structuur- en functieonderzoek, RNase-bescherming, probehybridisatie, RNA-interferentie, micro-injectie en in vitro vertaling.

2. Principes van in vitro transcriptie

Figuur 1. In vitro transcriptieproces

3. Voordelen van Yeasen T7 High Yield RNA-synthesekit

Extreem hoge opbrengsten: tot 200 µg in 2 uur
Veelzijdig: geschikt voor RNA-transcripten van 20nt-10000nt
Meervoudig gebruik: genereert ongemarkeerd, gelabeld of gecapt RNA

4. Productprestaties

Figuur 2. Vergelijking van IVT-opbrengsten

Let op: Alle reactiereagentia zijn afkomstig van T7 RNA-synthesekit (Yeasen#10623 of B* bedrijf). De IVT-reactie levert op: Yeasen en B*-bedrijf staan ​​hierboven weergegeven.

Figuur 3. De kwaliteit van transcriptieproducten voor verschillende lengtes

Figuur 4. Het expressieniveau van het getranscribeerde mRNA in HEK-293-cellen

Let op: Het mRNA is afgedekt met het vaccinia-afdekkende enzym (Yeasen(nr. 10614/10615)

5. Hoe deze kit te gebruiken

5.1 Ontdooi-reagentia

Centrifugeer de T7 RNA Polymerase Mix kort en plaats op ijs. Ontdooi 10× Transcription Buffer en ribonucleotiden (ATP, CTP, GTP, UTP), meng en centrifugeer tot de bodem van de buis, plaats 10× Transcription Buffer op kamertemperatuur en plaats vier soorten ribonucleotiden op ijs.

5.2 Bereid het transcriptiereactiesysteem voor volgens de volgende tabel

Tabel 1.Bereidingsmethode van het transcriptiereactiesysteem

Opmerking:
a) De reactie wordt bereid bij kamertemperatuur. Omdat de 10× Transcription Buffer spermidine bevat, zal de concentratie spermidine die te hoog is bij lage temperaturen DNA-templateprecipitatie veroorzaken.
b) Kort transcript (<100 nt), 2 µg template kan worden gebruikt, transcriptietijd verhoogd tot 4-8 uur.
c) Voor lange transcripten (>1000 nt) wordt het gebruik van gelineariseerde plasmide-sjablonen aanbevolen voor transcriptie.
d) Voer de reactie uit in het PCR-apparaat met het hete deksel open om te voorkomen dat de reactievloeistof te lang verdampt.
e) Het reactieproduct kan een witte neerslag hebben. Dit is magnesiumpyrofosfaat gevormd door vrij pyrofosfaat en magnesiumionen tijdens de reactie, wat de daaropvolgende experimenten niet zal beïnvloeden. U kunt EDTA toevoegen om het te verwijderen. Als u zich zorgen maakt dat de toevoeging van EDTA de daaropvolgende experimenten beïnvloedt, kan de supernatant ook worden teruggewonnen door middel van centrifugatie.
f) De reagentia en containers mogen geen RNase-verontreiniging bevatten.

5.3 Incubeer gedurende 2 uur bij 37°C

Meng de bovenstaande reactieoplossing, centrifugeer kort tot de bodem van de buis en incubeer gedurende 2 uur bij 37°C. Als de transcriptlengte minder dan 100 nt is, verhoog dan de reactietijd tot 4-8 uur.

5.4 DNase I-behandeling (optioneel)

Voeg na afloop van de reactie 2 μL DNase I (RNase-vrij) toe aan elk buisje en laat het 15 minuten bij 37°C incuberen om het template-DNA te verwijderen.

6. Veelgestelde vragen

6.1 De opbrengst van de IVT-reactie is laag

De templatekwaliteit is nauw verwant aan de opbrengst. Als de opbrengst van de experimentele groep significant lager is dan die van de positieve controlegroep, kunnen de mogelijke redenen zijn.
① De sjablonen bevatten componenten die de IVT-reactie remmen.
② Er is iets mis met de sjablonen.

6.2 Suggesties

① Reinig de sjabloon opnieuw.
② Bevestig de concentratie en integriteit van de sjablonen.
③ Verleng de reactietijd.
④ Verhoog de invoer van de sjabloon.
⑤Probeer andere RNA-polymerasen en bijbehorende promotoren.

6.3 De opbrengst van korte transcripten is laag

Als de doeltranscripten korter zijn dan 100 nt, verleng dan de reactietijd tot 4-8 uur of verhoog de invoer van sjablonen tot 2 ug in een 20 μL-reactiesysteem.

6.4 Er zijn onverwacht langere transcripties

Als de uitslag van de gelelektroforese laat zien dat er onverwacht langere transcripten zijn, kunnen de mogelijke redenen hiervoor zijn:
① Plasmide-sjablonen zijn mogelijk niet volledig gelineariseerd.
②Sjablonen hebben samenhangende uiteinden met 3' overhangen.
③Transcripten hebben een secundaire structuur die niet volledig gedenatureerd is.

6.5 Suggesties

①Controleer of plasmide-templates volledig gelineariseerd zijn. Voer indien nodig de plasmide-linearisatie opnieuw uit.
②Selecteer geschikte restrictie-enzymen om plasmide-templates te lineariseren en vermijd het produceren van cohesieve uiteinden met 3'-overhangen. Het is praktisch om Klenow-fragment of T4 DNA-polymerase te gebruiken om een ​​stomp uiteinde te produceren indien nodig.
③Gebruik gedenatureerde gel om transcripten te detecteren.

6.6 Er zijn onverwachte kortere transcripties

Als de uitslag van de gelelektroforese laat zien dat er onverwacht kortere transcripten zijn, kunnen de mogelijke redenen hiervoor zijn:
①Er is een sequentie die analoog is aan de terminatiesequentie van T7 RNA-polymerase in templates.
②Het GC-gehalte van sjablonen is hoog.

6.7 Suggesties

①Verlaag de reactietemperatuur (bijvoorbeeld 30℃), maar houd er rekening mee dat het verlagen van de reactietemperatuur soms de opbrengsten zal verlagen.
②Probeer andere RNA-polymerasen om de IVT-reactie te katalyseren.
③Als het GC-gehalte van de sjablonen hoog is, stel dan de IVT-reactietemperatuur in op 42℃ of voeg SSB toe aan het IVT-reactiesysteem om de opbrengsten en de lengte van de transcripten te vergroten.

6.8 Er is sprake van versmering van transcripten tijdens gelelektroforese

Als er sprake is van versmering van transcripten tijdens gelelektroforese, kunnen de mogelijke redenen hiervoor zijn:
①Er is sprake van RNase-verontreiniging tijdens de experimentele uitvoering.
②DNA-sjablonen zijn verontreinigd met RNases.

6.9 Suggesties

①Zorg ervoor dat alle reagentia zijn geformuleerd met RNase-vrije H2O. Gebruik RNase-vrije pipetpunten en Eppendorf-buisjes en draag wegwerphandschoenen en maskers van latex tijdens de experimentele uitvoering.
②DNA-sjablonen opnieuw zuiveren.

7. Bestelgegevens

Hieronder staan ​​representatieve producten die worden aangeboden door Yeasen. Er zijn extra formaten beschikbaar. Onze producten zijn zeer geoptimaliseerd om samen te werken, om superieure prestaties en reproduceerbaarheid te helpen garanderen.
Wij kunnen ook aangepaste diensten leveren. Als u geïnteresseerd bent in een product dat niet wordt getoond, neem dan contact met ons op en wij werken met u samen om aan uw behoeften te voldoen.

Tabel 2.Productinformatie

Over het lezen:

GMP-kwaliteit reagentia voor mRNA in vitro synthese

Yeasen Biotechnologie GMP-klasse mRNA In Vitro Synthese Grondstoffen