Ondanks het behalen van goede resultaten tijdens de pandemie en het tonen van een groot potentieel, heeft mRNA-technologie nog steeds verschillende beperkingen, zoals korte expressietijden en beperkte eiwittranslatie. Hoewel deze kenmerken een bepaald niveau van veiligheid kunnen bieden, worden ze beperkingen voor therapieën zoals eiwitvervanging. Dit vereist herhaalde dosering om eiwitexpressieniveaus te behouden, wat nieuwe risico's en uitdagingen introduceert, zoals immunogeniciteit en neutraliserende antilichamen.
Zelfversterkende RNA (saRNA) kan dezelfde immuunreactie genereren bij doses die honderden of zelfs duizenden keren kleiner zijn dan traditioneel mRNA. Lagere doses betekenen lagere productiekosten en minder frequente injecties kunnen potentiële toxische bijwerkingen van het mRNA en de toedieningsvectoren verminderen. Momenteel zijn er wereldwijd verschillende saRNA-kandidaten in klinische proeven opgenomen. Grote bedrijven zoals BioNTech zijn actief bezig met de ontwikkeling van saRNA-technologiepijplijnen.
Hoewel saRNA aanzienlijke kosten- en veiligheidsvoordelen biedt, brengt de unieke structuur nieuwe productie-uitdagingen met zich mee. Het saRNA-molecuul, dat de sequentie die codeert voor RNA-polymerase combineert met de doelproteïnesequentie, is veel groter (~10 kb) en complexer (bevat meer secundaire structuren) dan traditioneel mRNA. Dit vergroot de moeilijkheidsgraad van in vitro transcriptiereacties aanzienlijk, waardoor de opbrengst en zuiverheid van saRNA-productie afnemen. Daarom vereist saRNA-productie hogere normen in synthese-, scheidings- en zuiveringsprocessen.
Affiniteitschromatografie, een methode die wordt gebruikt voor scheiding en zuivering, kent problemen zoals een lage opbrengst en integriteit van het doelproduct. Het combineren van meerdere chromatografische zuiveringsmethoden (bijv. het toevoegen van cellulosechromatografie, hydrofobe reverse-phase chromatografie) is omslachtig, introduceert nieuwe onzuiverheden, heeft lage recovery rates en is kostbaar. Bovendien is het IVT-reactiesysteem dat wordt gebruikt voor grootschalige productie geoptimaliseerd van systemen die geschikt zijn voor het synthetiseren van 100nt nucleïnezuursequenties, waardoor het ongeschikt is voor saRNA, dat groter is dan 10 kb. Dit vereist de optimalisatie van bestaande IVT-reactiesystemen. Momenteel kunnen conventionele mRNA-zuiveringsmethoden niet voldoen aan de industriële vereisten voor ruwe vloeistofkwaliteit. Daarom is er een dringende behoefte om een compleet en efficiënt industrieel scheidings- en zuiveringsproces voor zelfversterkende RNA te ontwikkelen en optimaliseren.
Optimalisatie van industriële productie- en zuiveringsmethoden
Om een industrieel productiesysteem voor zelfversterkende mRNA (saRNA) te ontwikkelen, is het essentieel om eerst de bufferiontypen en componenten in het IVT-cotranscriptiesysteem op kleine schaal te optimaliseren. Dit omvat ook het verfijnen van de chromatografische buffer en monsterwasverhoudingen voor downstream-zuiveringsprocessen. Deze geoptimaliseerde omstandigheden kunnen vervolgens worden opgeschaald naar grootschalige productie om te verifiëren of het systeem de productiecapaciteit effectief kan verhogen en de kwaliteit van het ruwe product kan verbeteren.
Cotranscriptie Cap-Adding Reactie Systeem
In het cotranscriptie-cap-toevoegende reactiesysteem omvatten de T7-buffercomponenten 400 mM HEPES, 20 mM spermidine, 100 mM DTT en Mg2+-zouten.
T7 Buffer - Magnesium Ion Zout Type
Het type magnesiumionzout dat wordt gebruikt, heeft invloed op de opbrengst en integriteit van het beoogde saRNA-product.
- Voor kleinschalige cotranscriptiesynthese van 1 mg mRNA resulteert het gebruik van Mg(OAc)2 als Mg2+-zout in de beste opbrengst en integriteit, met waarden van respectievelijk 100,5 µg en 62,9%.
- Daarentegen leidt het gebruik van andere magnesiumionzouten, zoals MgCl2 en MgSO4, tot een vermindering van de opbrengst met ongeveer 25-50% en van de integriteit met ongeveer 10%, waardoor zowel de opbrengst als de integriteit aanzienlijk worden verlaagd.
T7 Buffer - Magnesiumionenconcentratie
Een optimale concentratie magnesiumacetaationen (30-50 mM) verbetert de opbrengst en integriteit van het doel-saRNA, met de beste resultaten bij 35 mM.
- Bij een magnesiumacetaationenconcentratie van 30-50 mM bedraagt de saRNA-opbrengst 88,5-100,5 µg en de integriteit 58,6-62,9%, wat goede resultaten oplevert.
- Bij een concentratie van 35 mM zijn de opbrengst en integriteit het hoogst en bedragen respectievelijk 100,5 µg en 62,9%.
T7 Buffer - Magnesium Ion Zout Gecombineerd met Andere Zouten
Door andere zouten aan de T7-buffer toe te voegen, kunnen de opbrengst en integriteit van het doelproduct aanzienlijk worden verbeterd.
- De basis T7-buffer bevat 400 mM HEPES, 20 mM spermidine, 100 mM DTT en Mg2+-zouten, wat resulteert in een opbrengst en integriteit van respectievelijk 100,5 µg en 62,9%.
- Door een tweede zout, NaOAc, toe te voegen, worden de opbrengst en integriteit nog verder verbeterd: de opbrengst neemt toe met 20-110 µg en de integriteit verbetert met ongeveer 2-8%.
T7 Buffer - Concentratie van Gecombineerde Zouten
Wanneer de tweede zoutcomponent NaOAc (Na+) een concentratie van 5-30 mM heeft, verbeteren de opbrengst en integriteit van het doel-saRNA aanzienlijk, met een optimale concentratie van 15 mM.
- Bij Na+-concentraties van 3-30 mM bedraagt de saRNA-opbrengst 120-210 µg en de integriteit 64,4-70,2%, wat goede resultaten oplevert.
- Bij een Na+-concentratie van 15 mM zijn de opbrengst en integriteit het hoogst en bedragen respectievelijk 210 µg en 70,2%.
Enkele zuiveringsmethoden
Tijdens kleinschalige (<50mg) saRNA-productie en -zuivering kan het gebruik van verschillende zuiveringsmethoden het dsRNA-gehalte en eiwitresiduen aanzienlijk verminderen, wat zorgt voor een hoge opbrengst, capping-efficiëntie en productintegriteit. De effectiviteit van de zuiveringsmethoden van beste tot slechtste is: affiniteitschromatografie > lithiumchlorideprecipitatie > ultrafiltratie, cellulosechromatografie.
-
Affiniteitschromatografie
Voor grootschalige mRNA-productie heeft chromatografie de voorkeur. Opties omvatten reverse-phase, ionenuitwisseling, hydrofobe en affiniteitschromatografie, elk met zijn voor- en nadelen. Affiniteitschromatografie, vaak gebruikt voor het vastleggen van poly(A) mRNA, biedt schaalbaarheid en platformoplossingen met >90% recovery rates.
De belangrijkste structurele kenmerken van mRNA, de 5'-cap en 3'-poly(A)-staart, vergemakkelijken de zuivering. Affiniteitschromatografie, vergelijkbaar met magnetische kralenzuivering, gebruikt dT-gekoppelde kralen om poly(A)-staart-mRNA te vangen. Hoge zoutcondities schermen negatieve ladingen af, waardoor binding via AT-waterstofbruggen mogelijk is, en mRNA wordt geëlueerd onder milde neutrale pH en lage geleidbaarheid.
Affiniteitschromatografie voor RNA omvat "hoge zoutbinding, lage zoutelutie." Buffersamenstelling, moleculaire grootte, temperatuur en monsterconcentratie hebben een significante impact op het proces. Het selecteren van het optimale zouttype en de concentratie door middel van experimenten is essentieel voor efficiënte zuivering.
Zuivering: Deze methode levert de hoogste productintegriteit (80,3%), het laagste dsRNA-gehalte (0,01 µg/mg), de hoogste capping-efficiëntie (96,4%) en de minste eiwitresten (1,20 µg/mg) op, met een opbrengst van 136 µg en een recoverypercentage van 65%. Daarmee is het de beste methode qua productzuiverheid en -kwaliteit.
-
Andere zuiveringsmethoden:
Lithiumchloride neerslag
Het principe van het zuiveren van mRNA met behulp van LiCl is dat lithium de elektrostatische afstoting tussen moleculen bij een bepaalde pH kan verminderen, waardoor efficiënte RNA-precipitatie mogelijk wordt.Het neerslag wordt vervolgens gescheiden door centrifugatie, opgelost om een zuiver RNA-monster te verkrijgen. LiCl-precipitatie is eenvoudig, snel, effectief voor mRNA's van verschillende groottes en levert producten met een hoge zuiverheid op. Echter, resterende lithiumionen kunnen mRNA remmen. Het wordt aanbevolen om LiCl-precipitatie te gebruiken voor oplossingen die ten minste 400 µg/ml RNA bevatten om de zuiveringsefficiëntie te garanderen. Deze methode levert een hoge opbrengst op (210 µg), maar de productintegriteit is slechts 70,2%, wat de productkwaliteit aanzienlijk vermindert. Het is niet geschikt voor grootschalige productie.
Magnetische kralenmethode:
Magnetische kralen zijn kleine deeltjes die directioneel bewegen onder een magnetisch veld, meestal samengesteld uit een ijzeroxide kern en een externe coating. Magnetische kralen zuivering is een veelgebruikte moleculair biologische techniek voor het snel en efficiënt verrijken van mRNA moleculen uit mengsels. Verschillende functionele magnetische kralen hebben verschillende oppervlakte functionele groepen (bijv. hydroxyl, carboxyl, Oligo(dT), streptavidine) voor het zuiveren van verschillende biomoleculen.
Gecarboxyleerde magnetische kralen kunnen nucleïnezuren efficiënt zuiveren, waarbij mRNA-moleculen zich binden via elektrostatische interacties onder zure omstandigheden. Door de omstandigheden aan te passen, kan mRNA selectief worden gebonden en vrijgegeven. Langere mRNA's met meer blootgestelde negatief geladen fosfaatgroepen binden zich gemakkelijker aan de kralen. Voor kortere mRNA's kunnen grotere kralenvolumes nodig zijn. Oligo(dT)-gekoppelde magnetische kralen, vergelijkbaar met affiniteitschromatografie, maken gebruik van specifieke binding tussen de poly(A)-staart van mRNA en de Oligo(dT) van de kralen.
Ultrafiltratie
Deze methode resulteert in de laagste saRNA-integriteit, ongeveer 8% lager dan affiniteitschromatografie, met het hoogste proteïneresidu (4,58 µg/mg).
Cellulosechromatografie
Deze methode bereikt een laag dsRNA-gehalte (0,009 µg/mg) en een hoge capping rate (96,4%). De eiwitresiduen zijn echter iets hoger (5,30 µg/mg), met een recovery rate van slechts 57% en een opbrengst van 120 µg, die beide aanzienlijk lager zijn dan die bereikt met affiniteitschromatografie (met respectievelijk ongeveer 10% en 16 µg).
Zuiveringsproces
Chromatografische buffercomponenten - Toevoeging van reductiemiddelen
Het toevoegen van reductiemiddelen aan de chromatografische buffer tijdens de zuivering kan de productintegriteit, het herstelpercentage en de capping-efficiëntie aanzienlijk verbeteren, terwijl de niveaus van bijproduct-dsRNA en eiwitresten worden verlaagd in vergelijking met het niet toevoegen van reductiemiddelen.
- Zonder reductiemiddelen:
- Opbrengst: 136 µg
- Herstelpercentage: 65%
- Integriteit: 80,3%
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 1,20 µg/mg
- De zuiverheid en kwaliteit van het product zijn goed.
- Met reductiemiddelen (TCPE, DTT, β-mercaptoethanol):
- Opbrengst neemt toe met 10-40 µg
- Herstelpercentage stijgt met 5-18%
- Integriteit verbetert met ongeveer 1-5%
- Afsluitrendement: 96,4%
- dsRNA: zo laag als 0,005 µg/mg
- Eiwitresidu: zo laag als 0,20 µg/mg
- Aanzienlijke verbetering van de zuiverheid en kwaliteit van het product.
Chromatografische buffercomponenten - Soorten reductiemiddelen
Verschillende soorten reductiemiddelen die aan de chromatografische buffer worden toegevoegd, kunnen de productintegriteit, het herstelpercentage en de capping-efficiëntie verder verbeteren, terwijl dsRNA- en proteïneresiduen worden gereduceerd. TCPE blijkt het meest effectieve reductiemiddel te zijn.
- Met TCPE:
- Opbrengst: 175 µg
- Herstelpercentage: 83%
- Integriteit: 85,2%
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 0,20 µg/mg
- Uitstekende productzuiverheid en kwaliteit.
Chromatografische buffercomponenten - Concentratie van reductiemiddelen
Het toevoegen van reductiemiddelen in een concentratie van 5-15 mM in de chromatografische buffer kan de productintegriteit, recovery rate en capping efficiency aanzienlijk verbeteren, terwijl dsRNA en proteïneresiduen worden verminderd. De optimale concentratie is 10 mM.
- 5-15 mM TCPE toevoegen:
- Opbrengst: 160-178 µg
- Herstelpercentage: 76-85%
- Integriteit: ongeveer 85%
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 0,20-0,52 µg/mg
- Goede productzuiverheid en kwaliteit.
- Met 10 mM TCPE:
- Opbrengst: 178 µg
- Herstelpercentage: 85%
- Integriteit: 85,4%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 0,20 µg/mg
- Optimale productzuiverheid en -kwaliteit.
Wasverhouding
Het regelen van de verhouding van chromatografische buffer tot injectiewater in het wasproces (10-25):(75-90) kan de productintegriteit, het herstelpercentage en de capping-efficiëntie aanzienlijk verbeteren, terwijl dsRNA- en proteïneresiduen worden verminderd. De optimale verhouding is 15:85.
- Verhouding (10-25):(75-90):
- Opbrengst: 150-179 µg
- Herstelpercentage: 71-85%
- Integriteit: 84-90%
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: ongeveer 0,20 µg/mg
- Goede productzuiverheid en kwaliteit.
- Met verhouding 15:85:
- Opbrengst: 179 µg
- Herstelpercentage: 85%
- Integriteit: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 0,20 µg/mg
- Optimale productzuiverheid en -kwaliteit.
Gecombineerde zuiveringsmethoden
Door een combinatie van verschillende zuiveringsmethoden te gebruiken, kunnen de niveaus van dsRNA en proteïneresiduen in het product verder worden verlaagd, waardoor de algehele kwaliteit wordt verbeterd. De voorkeursvolgorde van zuiveringsmethoden is: affiniteitschromatografie > ultrafiltratie + affiniteitschromatografie > affiniteitschromatografie + cellulosechromatografie > cellulosechromatografie + ultrafiltratie. Affiniteitschromatografie alleen levert de beste resultaten op.
-
Affiniteitschromatografie alleen:
- Opbrengst: 179 µg
- Herstelpercentage: 85%
- Integriteit: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Afsluitrendement: 96,4%
- Eiwitresidu: 0,20 µg/mg
- Hoogste productzuiverheid en kwaliteit.
-
Ultrafiltratie + Affiniteitschromatografie:
- Opbrengst: 170 µg (9 µg minder dan affiniteitschromatografie alleen)
- Herstelpercentage: 81% (4% minder dan alleen affiniteitschromatografie)
- Integriteit: 88,5%
- dsRNA: 0,0015 µg/mg
- Eiwitresidu: 0,18 µg/mg
- Lichte vermindering van dsRNA en proteïneresiduen vergeleken met affiniteitschromatografie alleen, maar significante vermindering van opbrengst en recovery rate. Deze methode is complexer, verdubbelt de zuiveringstijd en verhoogt de kosten.
-
Affiniteitschromatografie + Cellulosechromatografie / Cellulosechromatografie + Ultrafiltratie:
- dsRNA: 0,005 µg/mg lager dan enkele methoden
- Opbrengst: 60-100 µg minder
- Herstelpercentage: 30-40% lager
- Meer stappen leiden tot hogere arbeids- en materiaalkosten.
Grootschalige productie
Bij grootschalige productie, met behulp van affiniteitschromatografie, affiniteitschromatografie gecombineerd met cellulosechromatografie of ultrafiltratie gecombineerd met affiniteitschromatografie, neemt de opbrengst van zelfversterkende mRNA aanzienlijk toe tot 140-185 µg, met een recovery rate van 67-88%. De productintegriteit is 93-94%, het dsRNA-gehalte wordt gecontroleerd binnen 0,0018-0,0020 µg/mg, de capping efficiency bereikt 96,1-96,4% en de proteïneresiduen worden binnen 0,04-0,05 µg/mg gehouden. Dit toont een goede schaalbaarheid en efficiëntie voor grootschalige productie.
Referentie:
[8] Industriële productie- en scheidingszuiveringsmethoden van zelfversterkende mRNA-ruwe vloeistof en de toepassingen ervan [P]. Octrooi: CN118048418A. 2024.05.17.
Bestel Informatie