De Cap-structuur is een essentieel onderdeel in de ontwikkeling van mRNA-vaccins en -therapieën. Synthetische mRNA-technologie vertrouwt op Cap1 om de stabiliteit en translationele efficiëntie te verbeteren en de aangeboren immuunherkenning van mRNA door toll-like receptoren (TLR's) en andere immuunsensoren te verminderen, waardoor ongewenste immuunactivatie wordt geminimaliseerd. Dit voorkomt ongewenste ontstekingsreacties en verbetert zo de stabiliteit en effectiviteit van het therapeutische mRNA in menselijke cellen.
Vroege ontdekking en Cap0-structuur
Halverwege de jaren 70 werd door onderzoek naar eukaryotisch mRNA een 5'-terminale structuur ontdekt die nu bekendstaat als Cap0, waarbij een N7-methylguanosine-cap (m7G) aan het eerste nucleotide aan het 5'-uiteinde is bevestigd. Deze modificatie bleek mRNA te beschermen tegen afbraak door exonucleasen, te helpen bij nucleaire export en ribosomenherkenning te bevorderen voor translatie-initiatie. Cap0 was de eerste gekarakteriseerde cap-structuur, met zijn methylering beperkt tot de guanosine-cap zelf. De ontdekking van deze 5'-cap en zijn functies markeerde een belangrijke doorbraak in het begrijpen van eukaryotische mRNA-caps en hun rol in mRNA-modificaties.
De opkomst van Cap1
De Cap1-structuur, een cruciaal kenmerk van eukaryotisch mRNA, speelt een cruciale rol in de stabiliteit, translatie en immuunherkenning van mRNA. De mRNA-capstructuur, bestaande uit een N7-methylguanosine (m7G) gekoppeld aan het eerste nucleotide via een 5'-5'-trifosfaatverbinding, is geëvolueerd uit vroege studies naar post-transcriptionele modificaties van eukaryotisch mRNA in de jaren 70.
Structuur van 5'-end capped mRNA's.【1】 Verder onderzoek wees uit dat in de meeste eukaryotische mRNA's de eerste nucleotide na de cap (positie +1) ook gemethyleerd is op de 2'-O-positie van de ribose, een proces dat bekendstaat als 2'-O-methylering. Deze ontdekking, bekend als de Cap1-structuur (m7GpppNm), voegde een extra laag van functionele betekenis toe aan mRNA-modificaties. De Cap1-modificatie bleek de mRNA-stabiliteit nauwkeurig af te stemmen en immuunherkenning door het aangeboren immuunsysteem te voorkomen, met name in zoogdiercellen, waar het helpt herkenning door patroonherkenningsreceptoren zoals RIG-I, TLR's en MDA5【2】 te ontwijken. Dit was cruciaal voor zowel het mRNA-metabolisme als de vooruitgang van op mRNA gebaseerde technologieën, waaronder mRNA-vaccinatie en gentherapietoepassingen.
Technische uitdagingen in de mRNA-industrie en huidige oplossingen
Er zijn nog steeds verschillende technische uitdagingen in de wijdverbreide toepassing en optimalisatie van mRNA-vaccins, waaronder problemen met hoge doseringen mRNA, immuunreacties, stabiliteit en toediening. Een belangrijke uitdaging in de mRNA-industrie is de noodzaak van hoge doseringen mRNA om een robuuste immuunreactie op te wekken. Dit komt door verschillende factoren:
Snelle afbraak: mRNA is inherent onstabiel en gevoelig voor afbraak door decapping-enzymen en ribonucleasen (RNases) die aanwezig zijn in biologische systemen.
Beperkte translationele efficiëntie: De efficiëntie waarmee mRNA wordt vertaald naar proteïne kan variëren, waarbij hogere hoeveelheden mRNA nodig zijn om voldoende antigeenniveaus te genereren voor een immuunrespons. De translatie-efficiëntie is gerelateerd aan de affiniteit van Cap1 en translatie-initiatiefactor eIF4E.
De vorming van het basistranslatie-initiatiecomplex in eukaryoten.【3】
Immunogeniciteit en ongewenste immuunreacties: De derde grootste horde is de aangeboren immuunreactie die kan worden geactiveerd door het mRNA zelf, met name voor dsRNA of incompleet mRNA. Hoewel een bepaald niveau van immuunactivatie gewenst is om het adaptieve immuunsysteem te stimuleren, kan overmatige activatie leiden tot ontstekingsreacties, die de effectiviteit van het vaccin kunnen verminderen of bijwerkingen kunnen veroorzaken.
Geschiedenis van de Capping-technologie
-
Enzymatische cappingtechnologie: Enzymatische capping, geïntroduceerd in de begindagen van mRNA-onderzoek, omvat het gebruik van capping-enzymen zoals guanylyltransferase en methyltransferase om een natuurlijke 5'-cap post-transcriptioneel toe te voegen. Deze methode zorgt voor een hoge betrouwbaarheid en capping-efficiëntie in mRNA-translatie, met name voor therapeutische toepassingen.
-
Synthetische dop-analogen (jaren 80-2000): Onderzoekers ontwikkelden synthetische cap-analogen voor in vitro-synthese van gecapt mRNA, wat helpt bij het bestuderen van mRNA-functie en genexpressie. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) is een synthetische cap-analoog die is ontworpen om onjuiste cap-opname tijdens mRNA-synthese te voorkomen, wat de translatie-efficiëntie van mRNA voor vaccins en gentherapieën verbetert. De capping-efficiëntie en opbrengst van ARCA-capping is echter laag.
-
Cap1-technologie (jaren 2010): Cap1 van TriLink is een co-transcriptionele cappingmethode die het proces vereenvoudigt door de cap direct tijdens de mRNA-synthese te integreren. Deze methode verbetert de efficiëntie en levert een hoog percentage correct gecapped mRNA op, waardoor het ideaal is voor grootschalige therapeutische toepassingen zoals mRNA-vaccins.
Momenteel zijn enzymatische cappingtechnologieën van cruciaal belang bij de ontwikkeling van mRNA-gebaseerde therapieën, waaronder COVID-19-vaccins, omdat ze de stabiliteit en effectieve vertaling van therapeutisch mRNA garanderen.
Vergelijking van enzymatische capping, de volgende generatie LZCap Capping en de eerste generatie Capping (ARCA) methode
Ontwikkeling van de volgende generatie Cap-analogen
We wilden cap-analogen ontwikkelen met resistentie tegen decapping-enzymen, hoge affiniteit voor eIF4E om de translatie-efficiëntie te verbeteren en lagere immunogeniciteit. Deze ontwikkelingen zijn cruciaal voor het verbeteren van de effectiviteit van mRNA-gebaseerde therapieën, waaronder antikankerbehandelingen en gentherapietoepassingen.
Ontwerpen van LZCap
Bij het ontwerpen van LZCap hebben we ons vooral gericht op het creëren van een cap-analoog met een hoge affiniteit voor eIF4E. Enzymen hebben een relatief "specifieke" herkenning van substraten. Daarom streven we ernaar om bij het ontwerpen van een nieuwe cap-structuur zoveel mogelijk gelijkenis te behouden met natuurlijke/bekende structuren. De natuurlijke structuur heeft een ribose 3' OH, die kan worden aangepast (bijv. methylering). Op basis van deze overweging hebben we ervoor gekozen om een koolstof op de 3'-positie toe te voegen voor nieuwigheid, gevolgd door een NH om de waterstofbinding van OH na te bootsen, en vervolgens een acetylgroep om de basiciteit van NH te verminderen en het waterstofbindingsvermogen te verbeteren. De activiteit van LZCap is beter dan gemethyleerde natuurlijke cap, mogelijk vanwege verhoogde waterstofbinding. Vergeleken met de methyl- en methoxygroepen kan de acetylaminogroep ook de van der Waals-interacties tussen het substraat (cap) en de initiërende factor (enzym) vergroten.
Stabiliteit van de acetyl-aminogroep
De acetylaminogroep is al voldoende stabiel. Het is veel stabieler dan de 7-gemethyleerde positie en de fosfodiesterbinding, die de minst stabiele delen van de cap zijn.
Opbrengst en capping-efficiëntie van LZCap
Met LZCap AG(3'Acm) cap is de luciferase mRNA capping efficiency ongeveer 97,59%, en tot 200 μg gecapped mRNA kan worden verkregen met 1 μg DNA template in een standaard in vitro transcriptie (IVT) reactie met T7 RNA polymerase. De mRNA zuiverheid is tot 99% na eenvoudige LiCl precipitatie. Deze hoge capping efficiency en opbrengst maken LZCap een aantrekkelijke optie voor verschillende toepassingen, waaronder eiwitproductie en gentherapie.
De Cap-structuur is een essentieel onderdeel bij de ontwikkeling van mRNA-vaccins en -therapieën.Synthetische mRNA-technologie vertrouwt op Cap1 om de stabiliteit en translationele efficiëntie te verbeteren en de aangeboren immuunherkenning van mRNA door toll-like receptoren (TLR's) en andere immuunsensoren te verminderen, waardoor ongewenste immuunactivatie wordt geminimaliseerd. Dit voorkomt ongewenste ontstekingsreacties en verbetert zo de stabiliteit en effectiviteit van het therapeutische mRNA in menselijke cellen.
| Product | Pet AG (3'-O(Me-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (geen afdekking) |
| mRNA-opbrengst (μg) | 164 | 173 | 200 |
MS-analyse van de capping-efficiëntie van LZCapped Luciferase mRNA met RNAse H-gebaseerde methode. De capping-efficiëntie is ongeveer 97,59%,
Hoe is de mRNA-stabiliteit ten opzichte van het decapping-enzym?
mRNAs met LZCap AG(3'Acm) en LZCap AG M6 (3'Acm) vertonen een hogere resistentie tegen het decapping enzyme (NEB). Er wordt opgemerkt dat CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) ook resistent is tegen het decapping enzyme, maar de reguliere Cap AG (3'-OMe-7mG) vertoont geen resistentie.
Hoe is de bindingsaffiniteit van LZCap aan eIF4E?
Hoe zit het met de eiwitexpressie van LZCap AG(3'Acm) gecapped mRNA?
De expressie van LZCap AG(3'Acm) gecapped luciferase mRNA is significant hoger dan die van de Cap1 analoog (3'-OMe-7mG) gecapped mRNA in verschillende cellijnen* (3T3-L1，Hela，JAWs， HEK293T en Huh7). Het 130 herhalingsexperiment toonde een ongeveer 1,5 keer hogere expressie van LZCap AG(3'Acm) gecapped luciferase mRNA dan de (3'-OMe-7mG) gecapped mRNA gemiddeld. Een soortgelijk resultaat is waargenomen bij muizen. Het eiwitexpressieniveau kan licht variëren met verschillende mRNA-sequenties.
Heeft u nog meer gegevens over dieren?
De expressie-efficiëntie van LZCap AG(3'Acm) of LZCap AG(3'FMom) afgedekt
GLuc-coderende mRNA vertoont een hogere in vivo-expressie in vergelijking met CapAG (3'-OMe-7mG)-gekapte mRNA's in cynomolgusapen en varkens.
Hoe zit het met de aangeboren immunogeniciteit van LZCap AG gecapte mRNA's?
LZCapAG ( 3'Acm ) gecapte mRNA's vertonen een lage aangeboren immunogeniciteit. TLR8, TLR7, IL-1A en B spelen een belangrijke rol in de immuunrespons die wordt geïnduceerd door ongecapte RNA. De in vivo-studies van LZCapped mRNA-immunogeniciteitsanalyse toonden aan dat ongecapte RNA significante veranderingen in het transcriptieniveau van immuungerelateerde factoren bij muizen veroorzaakte. Zowel LZCap als 3'-OMe-7mG gecapte mRNA's vertonen een vergelijkbaar lager transcriptieniveau van immuunfactoren bij muizen na een enkele RNA-gestimuleerde injectie.
Heb je een veiligheidstest gedaan?
Ja, we hebben een cytotoxiciteitstest, een onderzoek naar de remming van humane polymerase en een Ames-test uitgevoerd.
- Er is geen of weinig cytotoxiciteit waargenomen voor het nucleosidemonomeer van 3'-Acm-7mG (CC50＞10000nM) in 293T-, Huh7-, MRC5-, THP1- en U87MG-cellen.
- Menselijk DNA-polymerase (α,β, γ en Klenow) en onderzoeken naar de remming van de activiteit van mitochondriaal RNA-polymerase (hPOLRMT) tonen aan dat 3'-Acm-7mG TP het menselijke DNA- of RNA-polymerase niet remt.
- De bacteriële reverse-mutatietest (Ames) detecteert geassocieerde genetische veranderingen, evenals genotoxische carcinogenen bij de meeste knaagdieren en mensen. De Ames-test toonde aan dat 3'-Acm-7mG geen genotoxiciteit heeft.
Is dit product gepatenteerd?
Ja. Het patent is verleend in de VS.
Bestelgegevens
| Productnaam | Specificaties | Catalogusnr. |
| LZCap AG (3'Acm) ( 100 mM） | 100 μL, 1 ml | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)( 100 mM） | 100 μL, 1 ml | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μL, 1 ml | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5) ( 25 mM） | 100 μL, 1 ml | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 mmol） | 100 μL, 1 ml | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μL, 1 ml | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-biotine) (25 mM) | 100 μL, 1 ml | Navraag |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μL, 1 ml | Navraag |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
| LZCap (AG(3'Acm) Vuurvlieg luc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Navraag |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 μL, 1 ml | Ionderzoek |
Referentie:
- Moleculaire mechanismen van coronavirus RNA-capping en methylering, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA-vaccins: een nieuw tijdperk in de vaccinologie. Nat. Rev. Drug. Ontdekking. 17, 261–279 (2018).
- Translatie-initiatie gereguleerd door RNA-bindend eiwit bij zoogdieren: de modulatie van het translatie-initiatiecomplex door trans-werkende factoren, cellen 2021, 10(7), 1711