Dit artikel beschrijft de toepassing van Concanavalin A en de covalente koppeling ervan met magnetische kralen.
Deel 1. Concanavaline A
Concanavalin A-Coated Magnetic Beads (ConA beads) zijn, zoals de naam al doet vermoeden, biomagnetische beads waarin de plantenlectine Concanavalin A (ConA) is gekoppeld aan superparamagnetische nanomaterialen. Hieronder volgt een korte introductie tot ConA Magnetic Beads.
Concanavalin A (ConA), een plantaardig lectine-eiwit zonder bloedgroepspecificiteit, was het eerste plantaardige lectine-eiwit dat werd geïsoleerd, gezuiverd en gekristalliseerd uit inktvis (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) sinds 1936.
ConA heeft 2 hoofdvormen, afhankelijk van de pH van de oplossing waarin het aanwezig is: het α-2-homodimeer of het α-4-homotetrameer [2]. Onder alkalische omstandigheden (pH>7,0) bestaat het als een tetrameer (bestaande uit vier moleculaire gewicht 26 kDa subeenheden); onder zure omstandigheden (pH 4,5-5,5) dissocieert Con A in een geactiveerde dimere structuur (52 kDa). Bovendien wordt de functie van ConA beïnvloed door divalente kationen, bijvoorbeeld bij afwezigheid van metaalionen (Ca2+ en Mn2+), kan de conformatie en glycoproteïnebindende functie ervan niet worden gerealiseerd[1].
Figuur (1). Moleculaire modellering van (A) ConA-monomeer, (B) ConA-dimeer, (C) ConA-tetrameer met mannose, glucose en metaalionen.
Deel 2. Kralen
Biomagnetische kralen zijn een klasse van magnetische microbolletjes met nanometer deeltjesgrootte, gevormd door polymeren en anorganische magnetische nanodeeltjes. Magnetische kralen kunnen worden ingedeeld in drie hoofdcategorieën op basis van hun structuur: kern-schil type structuur, sandwich type structuur en diffuse type structuur. Magnetische materialen omvatten puur ijzerpoeder, carbonylijzer, magnetisch erts, orthoferriet en ijzer-kobaltlegering, et al.
Magnetische nanomaterialen hebben vanwege hun speciale effecten, zoals het effect van de kleine afmetingen, het oppervlakte-effect en het kwantumgrootte-effect, enz., een grote Fe3O4 nanodeeltjes kleiner is dan 30 nm, is de interferentie van de thermische verstoring binnen de nanodeeltjes aanzienlijk en op dit moment vertonen deze nanodeeltjes een speciale magnetische eigenschap, d.w.z. superparamagnetisme. Superparamagnetisch Fe3O4 Nanodeeltjes worden op grote schaal gebruikt in de biologische industrie vanwege hun hoogwaardige eigenschappen, zoals niet-toxiciteit, goede biocompatibiliteit, unieke magnetische doelgerichte eigenschappen en gemakkelijke warmteontwikkeling in wisselende magnetische velden.
Daarentegen heeft de covalente koppeling van ConA met microbolletjes voor de immobilisatie van biomoleculen de volgende voordelen:
- Hoge stabiliteit van covalente koppelingsbinding voor reproduceerbaarheid;
- Ligand ConA-binding op het oppervlak van microbeads voor interacties met doelmoleculen;
- Kinetische karakterisering van de oplossingsomgeving, geschikt voor biologische experimentele manipulatie;
Deel 3. Toepassing van ConA magnetische kralen
Zoals in de literatuur wordt vermeld, worden de belangrijkste toepassingen van ConA-magnetische kralen onderverdeeld in 3 scenario's, namelijk het scheiden van cytoplasmatische membranen, het verrijken van glycoproteïnen en het scheiden van geïmmobiliseerde cellulaire aspecten.
Toepassing I: Scheiding van cytoplasmatische membranen
Met behulp van ConA magnetische kralen die worden beïnvloed door de activering van tweewaardige kationen, zodat het in Ca bestaat2+ en Mg2+ oplossingsomgevingen, die de functie van affiniteitsinteractie van terminale α-D-mannosyl en α-D-glucosyl bezitten, gebruikt in de zuivering van plasmamembranen, is een eenvoudige en efficiënte manier. Bijvoorbeeld, plasmamembraanscheiding van cellen of weefsels is een belangrijke stap om plasmamembraanproteïnen verder te verkrijgen. ConA is in staat om geglycosyleerde proteïnen op cellen te binden, en dit principe kan worden gebruikt om plasmamembraan met een hogere zuiverheid te verkrijgen. De belangrijkste operationele stappen zijn: immobilisatie van ConA op magnetische kralen door binding van gebiotinyleerde ConA aan streptavidine magnetische kralen; incubatie van celmembranen met ConA magnetische kralen gedurende 1 uur; adsorptie op een magnetisch rek; wassen met TBS gedurende 5 keer; en elutie van cytoplasmatische membraanoplossing met eluens[3].
Figuur 2. Zuiveringsstappen voor ConA-magnetische kralen voor plasmamembraan
Toepassing II: Glycoproteïneverrijking
ConA is specifiek voor mannose en glucose en herkent α-geconjugeerde mannose, wat toevallig de "kern oligosaccharide" is van veel serum- en celmembraan glycoproteïnen. Daarom kan het worden gebruikt in immunologie om geglycosyleerde moleculen zoals glycoproteïnen te scheiden in cel- of weefsellysaten of serum.
Een belangrijke procedure was dat door aminosilanized magnetic nanopearls (MNPs) te crosslinken met ConA via een bifunctionele linker, bis-N-hydroxysuccinimide linoleate (DSS), om ConA magnetische kralen te verkrijgen; om de niet-specifieke binding van de magnetische nanopearls te beëindigen met behulp van methoxyethyleenglycol (MEG), en om de magnetische scheiding uit te voeren; om het extract van de cellulaire membraaneiwitten die met trypsine zijn verteerd toe te voegen om zowel de ConA magnetische kralen als de gevangen glycopeptiden te incuberen, en om ten slotte de gevangen glycopeptiden te elueren, en om vacuümdrogen uit te voeren. ConA magnetische kralen werden beide geïncubeerd, de ConA magnetische kralen die gebonden glycoproteïnen hadden werden verzameld door het magnetische rek, de niet-glycopeptiden werden gewassen, en ten slotte werden de gevangen glycopeptiden geëlueerd en vacuümgedroogd. Deze methode maakt een diepgaande analyse mogelijk van specifieke glycosyleringsplaatsen van tumor-geassocieerde eiwitten (bijv. EGFR)[4].
Figuur 3. Superparamagnetische nanodeeltjes gekoppeld aan verschillende lectinen
Toepassing III: Isolatie van geïmmobiliseerde cellen
Het gebruik van ConA magnetische kralen (magnetische kralen covalent gebonden aan de zeer zuivere metgezel Concanavalin A) om te binden aan glycoproteïnen op celmembranen of kernmembranen, waardoor cellen of kernen worden gevangen, maakt visualisatie van experimentele manipulatie van kleine aantallen cellen mogelijk. ConA magnetische kralen worden bijvoorbeeld gebruikt in CUT&Tag en CUT&RUN [5] experimenten, nieuwe technieken om de structuur en functie van chromatine te bestuderen, worden geïmmobiliseerd door magnetische ConA-korrels aan de cellen te binden om de werking te visualiseren en het probleem van celverlies door centrifugatie te voorkomen.
Vergeleken met de traditionele ChIP-seq-technologie voor het bestuderen van DNA-proteïne-interacties hebben CUT&Tag en CUT&RUN de volgende voordelen:
- ConA-magnetische kralen binden zich aan glycoproteïnen van het celmembraan om de werking te visualiseren en de experimentele operationele ervaring te verbeteren;
- Centrifugatie is niet nodig, alleen ConA-magnetische kralen worden geadsorbeerd op het magnetische rek om de scheiding van celmonsters en oplossingen te voltooien;
- Kan worden gebruikt met minimaal 10 cellen, waardoor er geen groot aantal samples nodig is voor ChIP-seq.
Figuur 4. Schematisch diagram van ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN experimentstroom
Deel 4.
ConA magnetische kralen, ontwikkeld door
1.Producteigenschappen
- Stabiele batchproductie en betere reproduceerbaarheid van resultaten;
- Stabiele prestatieopslag
- Celvangstefficiëntie>90%
2. Productinformatie
| Cat.nr. | Cat.nr. 19810ES |
| Maat | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Kleur | Bruinachtig geel |
| Kralenconcentratie | 10 mg/ml |
| Vaste inhoud | 9-11 mg/ml |
| Kraalgrootte | 1 µm |
| Capaciteit | 105 cellen/µL kralen |
3. Productprestatiegegevens
(1)Monodispersiteit
Onder dezelfde behandelingsomstandigheden en bij een vergroting van 10×/40× waren de ConA-korrels in principe monodispers en werd er geen duidelijke agglomeratie waargenomen ten opzichte van de concurrent.
| | Concurrent ConA kralen | |
Figuur 5. Grafiek van monodispersiteitsresultaten
(2)Effect van ConA-kralen die cellen binden
Hetzelfde aantal cellen werd gedurende dezelfde tijd met de kralen geïncubeerd en het aantal cellen dat overbleef na conjugatie van de ConA-kralen werd automatisch gedetecteerd onder de celanalysator en de resultaten lieten zien dat de
| Celsuspensie | Cellen die overblijven na binding van competitieve ConA magnetische kralen | Cellen die overblijven na binding van |
Figuur 6.Afbeelding van ConA magnetische kralen gebonden cellen
(3) Celbindingsgetal en herhaalbaarheid
Zowel de 10µL
Figuur 7. De resultaten van ConA-kralen die het celaantal en de vangstsnelheid binden
(4)Versnellingsstabiliteit
Verstrek 1 ml/tube. De opslagcondities waren: 4℃, 37℃ versnelde behandeling gedurende 2, 4, 7, 11 en 14 dagen, en -20℃ vernietigingsbehandeling gedurende 1, 3, 6 en 8 dagen. De resultaten toonden aan dat onder dezelfde experimentele condities: de celvangstsnelheid van de producten opgeslagen bij 4℃, versnelde behandeling bij 37℃ en vernietigingsbehandeling bij -20℃ >95% was, en de CV-waarde van de drie groepen replicaten onder elke behandelingsconditie binnen 1% lag, wat een goede reproduceerbaarheid liet zien.
Figuur 8. De resultaten van de celvangstsnelheid en de herhaalbaarheidsbias van ConA-kralen bij verschillende temperaturen en tijden
Bestelgegevens
| 19810ES |