Nucleïnezuurkwantificering, als een van de meest fundamentele experimenten in de moleculaire biologie, heeft direct invloed op de uitkomst van downstream-experimenten. De nauwkeurigheid van nucleïnezuurkwantificering is cruciaal. Momenteel zijn er twee hoofdmethoden voor NGS-bibliotheekkwantificering, de ultravioletabsorptiemethode en de fluorescerende kleurstofmethode.

De ultraviolet-absorptiemethode gebruikt een spectrofotometer om de absorptie bij 260 nm te meten voor DNA en RNA tot kwantificering. Het schat ook de zuiverheid van nucleïnezuren door de OD260/OD280-verhouding te berekenen. De gedetecteerde waarden zijn echter zeer gevoelig voor interferentie van andere verontreinigingen zoals vrije nucleotiden, zouten en organische verbindingen.

Qubit fluorometrische kwantificering maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen die specifiek binden aan dubbelstrengs DNA, enkelstrengs DNA, RNA of eiwitten. Bij excitatie door een lichtbron met een specifieke golflengte zenden de kleurstoffen fluorescentie uit, die niet wordt beïnvloed door andere onzuiverheidsmoleculen die mogelijk in het monster aanwezig zijn. De fluorescentie-intensiteit is evenredig met de concentratie van de doelmoleculen in het monster.

Tabel 1. Vergelijking van gangbare methoden voor de kwantificering van nucleïnezuren

Doel	UV-Abs (Nanodrop)	Qubit-DNA HS	Qubit-DNA BR	Qubit-RNA	Qubit-ssDNA
Type nucleïnezuur	DNA, RNA	dsDNA	dsDNA	RNA	ssDNA, oligo
Monsterconcentratie (ng/μL)	2 ng/μL-15 μg/μL	10 pg/µL-100 ng/µL	0,1 ng/µL-1000 ng/µL	250 pg/µl-1000 ng/µl	50 pg/μL-200 ng/μL
Voordeel	Hogere kwantificatielimiet	Goede specificiteit	Breed scala aan kwantificering	Zeer selectief voor RNA	Goed verdragen
Beperkingen	Slechte specificiteit	Bescherm tegen licht tijdens gebruik	Bescherm tegen licht tijdens gebruik	Bescherm tegen licht tijdens gebruik	Slechte specificiteit en bindt ook dsDNA

UV-absorptie en Qubit-fluorometrische kwantificering hebben elk hun voordelen en kunnen elkaar aanvullen. Voor voorlopige kwantificering van routinematige nucleïnezuurmonsters om de concentratie, zuiverheid en de aanwezigheid van verontreinigingen te bepalen, kan de absorptiekwantificeringsmethode worden gekozen. Qubit-kwantificering is geschikter voor kostbare monsters met een lage concentratie of voor nauwkeurige kwantificering die nodig is voor vervolgexperimenten, zoals next-generation sequencing en real-time kwantitatieve PCR.

Yeasen heeft verschillende Qubit-kwantificatieproducten gelanceerd: dsDNA HS Assay Kit voor Qubit^® (Cat#12640), Klaar voor gebruik: 1× dsDNA HS Assay Kit voor Qubit^® (Cat#12642), ssDNA-testkit voor Qubit^® (Cat#12645) en dsDNA BR Assay Kit (Cat#12643), die sinds hun lancering alom geprezen zijn.

Oplossing 1 dsDNA HS Hoge Gevoeligheid Kwantificering

Gebruiksklare dsDNA-kwantificatiepremix - 1× dsDNA HS-assaykit voor Qubit^®

^{Eenvoudige bediening: kant-en-klare premix, geen voormenging nodig;}

^{Hoge gevoeligheid: detecteerbare concentratie zo laag als 50 pg/μL;}

^{Goede stabiliteit: het fluorescentiesignaal blijft 3 uur aanhouden en opslag bij kamertemperatuur gedurende 20 dagen heeft geen invloed op de nauwkeurigheid van de kwantificering;}

^{A. Uitstekende stabiliteit: Zelfs bij opslag bij kamertemperatuur gedurende 2 weken blijft de stabiliteit behouden (de gemeten waarde wijkt minder dan 10% af van de theoretische waarde).}

Tabel 2. Stabiliteitstest van verschillende monsters bij 4°C en kamertemperatuur vergeleken met concurrenten

Kwantitatieve reagentia	Bepaald concentratie van λDNA (ng/μL)
	0d		1d		3d	7d			10d		14d
T* 4℃	0,51		0,496		0,524	0,534			0,495		0,499
Yeasen 4℃	0,51		0,508		0,513	0,475			0,48		0,495
Yeasen kamertemperatuur opslag	0,51		0,517		0,506	0,486			0,506		0,523
Kwantitatieve reagentia	Bepaald concentratie van kalf gDNA (ng/μL)
	0d	1d		3d			7d	10d		14d
T* 4℃	55.3	53.5		55.40			57.9	55.8		58
Yeasen 4℃	59.4	55.4		57.8			56.1	56.3		59.8
Yeasen kamertemperatuur opslag	59	55.7		61.3			58	58.7		56.1

B. Hoge gevoeligheid, goede batch-tot-batch stabiliteit

Tabel 3.Stabiliteitstest van verschillende batches

Bbijten	Steekproef	L*			Yeasen			fout
		concentratie1 (ng/μL)	concentratie2 (ng/μL)	Gemiddeld (ng/μL)	concentratie1 (ng/μL)	concentratie2 (ng/μL)	Gemiddeld (ng/μL)
D9801060	λDNA	0,3160	0,3250	0,3205	0,320	0,320	0,320	0,16%
D8801050		0,3310	0,3320	0,3315	0,319	0,306	0,3125	5,73%
D7813110		0,345	0,358	0,352	0,334	0,329	0,332	-6,03%

Oplossing 2 dsDNA BR Breedbereik Kwantificering

Breed scala aan dsDNA-kwantificering - dsDNA BR Assay Kit

Hoge gevoeligheid: detecteerbare concentratie zo laag als 50 pg/μL;

Uitstekende lineariteit: Goede lineariteit binnen het bereik van 2-1000 ng;

Sterke tolerantie voor verontreinigingen: Kan veelvoorkomende verontreinigingen tolereren.

Tabel 4. Stabiliteit en tolerantie voor verontreinigingen vergeleken met concurrenten

Yeasen BR						T* BR
standaard	RFU1	RFU2	AVG	fout		standaard	RFU1	RFU2	AVG	fout
S1	159.63	160.71	160.17	1%		S1	216.17	211.56	213.865	-2%
S2	24497.0	25078.64	24787.82	2%		S2	20532.46	20452.26	20492.36	0%
meting						meting
Verontreiniging	Concentratie in 10-μL monster	concentratie1	concentratie2	AVG	Te testen/controleren	Verontreiniging	Concentratie in 10-μL monster	concentratie1	concentratie2	AVG	Te testen/controleren
Controle (H2O)	/	49	48.6	48.8	0,0%	Controle (H2O)	/	49.8	48	48.9	0,0%
BSA	1 mg/ml	51.8	52	51.9	6,4%	BSA	1 mg/ml	54	51.2	52.6	7,6%
Ethanol	20%	44.6	44	44.3	-9,2%	Ethanol	20%	44.8	43.4	44.1	-9,8%
chloroform	4,00%	49.0	49.8	49.4	1,2%	chloroform	4,00%	50.0	47	48.5	-0,8%
Veiligheidsinformatieblad	0,2%	46.6	45.8	46.2	-5,3%	Veiligheidsinformatieblad	0,2%	53.2	51.6	52.4	7,2%
Trition-X100	0,20%	41.6	40.6	41.1	-15,8%	Trition-X100	0.20%	53	51	52.0	6,3%
dNTP's	2mM	44.2	45	44.6	-8,6%	dNTP's	2mM	47.8	46.4	47.1	-3,7%

Oplossing 3 ssDNA-kwantificering

De ideale keuze voor ssDNA-kwantificering: een hoogwaardige ssDNA-assaykit voor Qubit^®

^{Hoge gevoeligheid: detecteerbare concentratie zo laag als 50 pg/μL;
Uitstekende lineariteit: Goede lineariteit binnen het bereik van 0-200 ng;
Stabiel signaal: uitstekende kleurstof gecombineerd met verbeterde geoptimaliseerde buffer, kan een stabiele fluorescentie-intensiteit behouden bij kamertemperatuur en is zeer toepasbaar, zelfs in veelvoorkomende vervuilingsomgevingen zoals zouten, vrije nucleotiden, oplosmiddelen, detergenten of eiwitten, wat zorgt voor een nauwkeurige kwantificering;
Goede stabiliteit: Geen significante prestatieveranderingen na 6 maanden behandeling bij 4°C of 25°C;
Breed toepassingsgebied: Eenvoudig bedieningsproces, waardoor snelle kwantificering van oligonucleotiden, primers, gedenatureerd DNA, enkelstrengs circulair DNA, enz. mogelijk is.}

A. Goede herhaalbaarheid: Kwantificering in verschillende Qubit-instrumenten, verschillende soorten monsters met behulp van Yeasen meerdere batches Cat#12645 getest. Binnen het bereik van 0-200ng, goede herhaalbaarheid in metingen van verschillende Qubit-instrumenten.