De HEK293 Host Cell Residual DNA Fragment Analysis Kit is ontworpen voor de kwantitatieve analyse van HEK293 rest-DNA-fragmenten van verschillende lengtes in tussenproducten, halffabrikaten en eindproducten van biologische preparaten. Deze kit maakt gebruik van het qPCR-fluorescentieprobeprincipe om specifiek en snel HEK293-DNA-residuen te detecteren, zowel onder als boven 200 basenparen, met een kwantificeringslimiet van slechts 10 fg/μL. Het bevat ook de HEK293 DNA Control (DNA-kwantitatieve referentie). Deze kit kan worden gebruikt in combinatie met de magnetische kralengebaseerde rest-DNA-monsterbereidingskits van het bedrijf (Cat.nr. 18461ES(/18462ES).

Productinformatie

Onderdeel

Opslag en verzending:

1. Alle componenten worden verzonden op droogijs en dienen bij ontvangst te worden bewaard bij -25°C tot -15°C. De houdbaarheid is 2 jaar. Componenten A en B1, B2, B3 en B4 dienen beschermd tegen licht te worden bewaard.

2. Controleer bij ontvangst of alle 7 componenten aanwezig zijn en bewaar ze onmiddellijk bij de aanbevolen temperaturen.

Voorzorgsmaatregelen:

1. Dit product is uitsluitend bedoeld voor onderzoeksdoeleinden.

2. Om veiligheids- en gezondheidsredenen verzoeken wij u om tijdens de operatie een laboratoriumjas en wegwerphandschoenen te dragen.

3. Lees de gebruiksaanwijzing zorgvuldig door voordat u dit reagens gebruikt. Experimenten moeten worden uitgevoerd volgens standaardprocedures, waaronder monsterbehandeling, bereiding van reactiemengsels en pipetteren.

4. Elk onderdeel moet vóór gebruik grondig worden gemengd door voorzichtig te schudden en kort te centrifugeren.

Compatibele instrumenten:

Inclusief maar niet beperkt tot de volgende instrumenten: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: CFX96 optische module, Shanghai Hongshi medische technologie: SLAN-96S

Gebruiksaanwijzing

1. Verdunning van HEK293 DNA-controle Kwantitatieve referentie en voorbereiding van standaardcurven

De HEK293 Fragment Analysis Kit bevat vier amplificatiefragmenten van verschillende lengtes: 82 bp, 133 bp, 227 bp en 515 bp. Wanneer u standaardcurven vaststelt, stelt u afzonderlijke curven in voor elk amplificatiefragment en berekent u hun resterende hoeveelheden en relatieve distributies op basis van de overeenkomstige standaardcurven.

Gebruik de DNA-verdunningsbuffer die in de kit is meegeleverd om een ​​gradiëntverdunning van de HEK293 DNA Control Quantitative Reference uit te voeren. De verdunningsconcentraties moeten zijn: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL en 30 fg/μL.

De details zijn als volgt

1). Plaats de HEK293 DNA Control en DNA Dilution Buffer uit de kit op ijs om te ontdooien. Na volledig ontdooien, zachtjes vortexen om te mengen en kort centrifugeren (10 seconden) om de oplossing op de bodem van de buis te verzamelen.

2)Bereid zes schone centrifugebuizen van 1,5 ml voor en label ze als Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 en Std5.

3). Voeg in de buis met het label Std0 90 μL DNA Dilution Buffer en 10 μL HEK293 DNA Control toe om een ​​concentratie van 3 ng/μL te bereiken. Vortex voorzichtig om te mengen en centrifugeer kort (10 seconden). Deze concentratie kan worden gealiquoteerd en bewaard bij -20°C voor kortdurend gebruik (tot 3 maanden). Vermijd herhaalde vries-dooicycli.

4). Voeg in de buisjes met het label Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 en Std5 eerst 90 μL DNA Dilution Buffer toe aan elk. Elke verdunningsstap moet voorzichtig worden gemengd en kort worden gecentrifugeerd om uniformiteit te garanderen. Voer vervolgens een gradiënt uit verdunningen als volgt:

Tabel 1: Standaardgradiëntverdunning

* Voer voor elke concentratie 3 replicaties uit. Dit reagens kan testen binnen een lineair bereik van 300 pg/μL tot 30 fg/μL. Indien nodig kan het lineaire bereik op passende wijze worden uitgebreid of vernauwd.

** Om herhaalde vries-dooicycli te verminderen en besmetting te voorkomen, wordt aanbevolen om de DNA-kwantificering te verdelen en op te slaan SStandaard bij -20°C voor het eerste gebruik.

*** Ongebruikte, ontdooide DNA-verdunning kan tot 7 dagen worden bewaard bij 2-8°C. Als het langere tijd niet wordt gebruikt, bewaar het dan bij -20°C.

**** Om een ​​volledige menging van de mal te garanderen, schudt u elke gradiëntverdunning voorzichtig gedurende ongeveer 1 minuut.

2. Voorbereiding van het testmonster (TS)

Bereid het testmonster TS voor volgens de experimentele opstelling, als volgt:

1) Neem 100 μL van het testmonster en voeg het toe aan een schone centrifugebuis van 1,5 ml. Label het als TS, voer een monstervoorbehandeling uit en bereid tO zuiveren de testmonster.

2) Om te voldoen aan de vereiste voor het gelijktijdig analyseren van vier verschillende extensielengtes, moet de hoeveelheid voorbehandeld testmonster ≥120 μL zijn. Daarom wordt aanbevolen om 2 buizen van elk monster voor te bereiden voor voorbehandeling en ze na extractie te mengen voor gebruik.

3. Voorbereiding van negatieve extractiecontrole (NCS)

Bereid de negatieve extractiecontrole NCS voor volgens de experimentele opstelling, als volgt:

1) Neem 100 μL van de monstermatrixoplossing (of DNA-verdunning) buffer) en voeg het toe aan een schone centrifugebuis van 1,5 ml. Label het als NCS.

2) Voer de monstervoorbehandeling van de negatieve controle NCS uit samen met de batch testmonsters en bereid de gezuiverde negatieve controle NCS-oplossing.

3) Om te voldoen aan de vereiste voor het gelijktijdig analyseren van vier verschillende extensielengtes, moet de hoeveelheid voorbehandeld NCS-monster ≥120 μL zijn. Daarom wordt aanbevolen om 2 buizen van elk NCS-monster voor te bereiden voor voorbehandeling en ze na extractie samen te mengen voor gebruik.

4. Voorbereiding van No Template Control (NTC)

Bereid de NTC zonder templatecontrole voor volgens de experimentele opstelling, als volgt:

1) Geen sjablooncontrole (NTC) vereist geen monster voorbehandeling, en kan worden bereid vanaf het stadium van het detecteren van rest-DNA-inhoud met behulp van qPCR.

2) Voor elke buis of put bestaat het NTC-monster uit 20 μL mix (d.w.z. 15 μL HEK293 qPCR Mix + 5 μL overeenkomstige HEK293 Primer & Probe Mix) + 10 μL DNA Dilution Buffer. Het wordt aanbevolen om voldoende te bereiden voor 3 replicaatputten.

5. qPCR-reactiesysteem

Tafel 2. Reactiesysteem voor Fragment van 82 bp

Tafel 3. Reactiesysteem voor 133 bp-fragment

Tafel 4. Reactiesysteem voor 227 bp-fragment

Tafel 5. Reactiesysteem voor 515 bp-fragment

* Om de totale hoeveelheid Mix te berekenen die nodig is voor deze reactie op basis van het aantal putjes:

Mix = (Aantal reactieputjes + 2) × (15 + 5) μL (om rekening te houden met het verlies van de 2 putjes). Normaal gesproken worden er voor elk monster 3 replicaatputjes bereid.

** Aantal reactieputjes = (5 putjes met concentratiegradiëntstandaardcurve + 1 controle zonder template (NTC) + 1 negatieve controleoplossing (NCS) + N testmonsters (TS)) × 3.

NTC (geen templatecontrole): DNA-verdunningsbuffer

NCS (Negatieve Controle Oplossing): Monstermatrixoplossing of DNA-verdunningsbuffer na monstervoorbehandeling-behandeling om de gezuiverde oplossing te verkrijgen, de NCS.

TS (Test Sample): Het te testen monster.

***Nadat u de monsters hebt gedoseerd en de buizen hebt afgesloten, centrifugeert u kort op lage snelheid (10 sec) om de vloeistof van de buiswanden naar de bodem te verzamelen. Vortex vervolgens ten minste 5 seconden om grondig te mengen. Voer daarna nog een lage snelheidscentrifuge uit (10 sec). Als er bellen zijn, zorg er dan voor dat u deze verwijdert.

Tabel 6: Referentieplaatlay-out

Dit voorbeeld showis de qPCR-detectieprocedure voor het analyseren van de amplificatiefragmenten van resterend HEK293-DNA.De testmonsters omvatten: 5 concentratiegradiënten van HEK293 DNA-standaardcurve, 1 testmonster (TS), 1 negatieve controleoplossing (NCS) en 1 no-template controle (NTC). Het wordt aanbevolen om 3 replicaatputjes voor elk monster te gebruiken.

6. Parameters van het versterkingsprogramma (Thier-stapmethode) (Voorbeeld met ABI 7500 qPCR Instrument, softwareversie 2.0)**

1) Maak een nieuw leeg programma en selecteer 'Absolute kwantificering' als detectiesjabloon.

2) Maak voor de vier verschillende amplificatiefragmentlengtes nieuwe detectieprobes en noem ze "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227" en "HEK293-515". Selecteer de reporterfluorofoor als "FAM" en de quencherfluorofoor als "geen". Stel de referentiekleurstof voor detectie in als "ROX" (de referentiekleurstof kan worden toegevoegd of niet, afhankelijk van het instrumentmodel en andere factoren).

3) In het paneel "Assign target(s) to the selected wells" stelt u het veld "Task" voor de standaardcurvewells in als "Standard" en wijst u de overeenkomstige waarden in het veld "Quantity" toe als "300000", "30000", "3000", "300", "30" (die de DNA-concentratie per well vertegenwoordigen, in fg/μL). Geef de wells in het veld "Sample Name" de naam "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Voor de NTC-wells stelt u de "Task" in op "NTC". Voor de NCS- en TS-wells stelt u de "Task" in op "Unknown" en geeft u de wells de naam "NCS" en "TS" in het veld "Sample Name". Nadat u deze parameters hebt ingesteld, klikt u op 'Start Run' om de instrumentrun te starten.

4) Instellingen voor het amplificatieprogramma: Stel het driestaps amplificatieprogramma in, met een reactievolume van 30 μL.

Tafel7. PCR-procedure

7. qPCR-resultaatanalyse

1) In het paneel "Analyse" onder "Amplification Plot" stelt het systeem automatisch de "Threshold" in. Soms ligt de standaard "Threshold" te dicht bij de basislijn, waardoor er aanzienlijke Ct-variatie tussen replicaten ontstaat. U kunt de "Threshold" handmatig aanpassen naar een geschikte positie en op "Analyze" klikken. Op dit punt kunt u de amplificatiecurven in de "Multicomponent Plot" voorlopig controleren om te zien of ze normaal zijn.

2) In het paneel "Analyse" onder "Standaardcurve" kunt u de R², versterkingsefficiëntie (Eff%), helling en intercept van de standaardcurve aflezen. Voor een normale standaardcurve: R² > 0,99, versterkingsefficiëntie (90% ≤ Eff% ≤ 110%) en helling tussen -3,6 en -3,1.

3) In het paneel "Analyse" onder "Bekijk welltabel" kunt u de kolom "Hoeveelheid" lezen voor no-template control (NTC), negatieve controle (NCS) en testmonsters (TS), met de eenheid in fg/μL. De eenheden kunnen later in het rapport worden omgezet.

4) De parameterinstellingen voor resultaatanalyse moeten afhankelijk zijn van het specifieke instrumentmodel en de softwareversie. Meestal kan het instrument de resultaten automatisch interpreteren.

5) De Ct-waarde van de negatieve controle (NCS) moet groter zijn dan de gemiddelde Ct-waarde van de laagste concentratie van de standaardcurve.

6) Het resultaat van de no-template control (NTC) moet 'Onbepaald' zijn of een Ct-waarde ≥ 32 hebben.

Document

Handmatig