O que é Aureobasidina A
Aureobasidina A (AbA) é um antibiótico peptídico cíclico isolado do fungo filamentoso Aureobasidium pullulans No. R106, que tem fortes propriedades antifúngicas e pode ser tóxico para leveduras em baixas concentrações (0,1-0,5 μg/mL). O mecanismo de ação do AbA é através da inibição da atividade da inositol fosforilceramida sintase (IPC sintase), uma enzima codificada pelo gene AUR1 na levedura, bloqueando a síntese de ceramida para fosfolipídios de inositol, levando a uma deficiência de esfingolipídios, ruptura da membrana celular e, portanto, matando a cepa. As espécies fúngicas sensíveis ao AbA incluem Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans e A. niger.
Figura 1 Fórmula estrutural de AbA, CAS#127785-64-2
Pesquisas descobriram que o gene AUR1 de Saccharomyces cerevisiae e o gene AURA de Aspergillus nidulans são homólogos, ambos codificando a IPC sintase. Portanto, mutações nesses dois genes podem conferir forte resistência AbA a cepas, como o gene mutado AUR1-C. AbA é muito adequado como um marcador de seleção de drogas para triagem de clones positivos, e não requer otimização de condições, com um fundo muito baixo. A resistência AbA também é um repórter ideal para estudos de híbridos simples/duplos de levedura e é compatível com sistemas híbridos de levedura carregando resistência correspondente.
O que é o Sistema Híbrido Simples/Duplo de Levedura
O sistema de dois híbridos de levedura (ensaio de dois híbridos de levedura) foi criado por Fields e Song e outros com base nas características da regulação transcricional eucariótica. Ele pode analisar de forma rápida e direta as interações entre proteínas conhecidas e é amplamente utilizado no estudo de interações antígeno-anticorpo, na descoberta de novas proteínas e novas funções proteicas, na triagem de alvos de drogas e no estabelecimento de mapas de ligação de proteínas genômicas. O princípio do dois híbridos de levedura é que o ativador transcricional de eucariotos contém dois domínios estruturais diferentes: o domínio de ligação ao DNA (domínio de ligação ao DNA, DNA-BD) e o domínio de ativação da transcrição do DNA (domínio de ativação, AD), que podem ser separados independentemente sem afetar a função um do outro. BD e AD sozinhos não podem ativar a resposta transcricional, somente quando os dois estão espacialmente próximos o suficiente, eles exibem a atividade de um ativador transcricional completo, permitindo que o gene a jusante seja transcrito. Ao construir plasmídeos de fusão das duas proteínas em estudo (proteína X e proteína Y) com domínios BD e AD respectivamente e expressá-los na mesma célula de levedura, se não houver interação entre as duas proteínas, o gene repórter não será transcrito; se as duas proteínas interagirem, os domínios BD e AD estarão espacialmente próximos, portanto o gene repórter é transcrito.
Figura 2 Diagrama do princípio da levedura bi-híbrida [1]
A tecnologia de um híbrido de levedura é uma ferramenta para estudar interações ácido nucleico-proteína, desenvolvida com base no híbrido de dois híbridos de levedura, e é amplamente usada para estudar a regulação da expressão de genes em células eucarióticas, como identificar se há uma interação entre DNA conhecido e proteínas conhecidas; isolar novas proteínas que se ligam ao elemento cis-regulador alvo ou outros sítios de ligação de DNA curtos; localizar com precisão os sítios de ligação de DNA que comprovadamente interagem e analisar os domínios de ligação de DNA de proteínas. Seu princípio básico é construir o elemento cis-atuante conhecido a montante do promotor mais básico (promotor mínimo, Pmin) e conectar o gene repórter a jusante de Pmin. O cDNA que codifica o fator de transcrição a ser testado é fundido com o vetor de expressão do domínio AD de levedura e introduzido em células de levedura.Se o produto desse gene puder se ligar ao elemento de ação cis, ele poderá ativar o promotor Pmin, permitindo que o gene repórter seja expresso.
Figura 3 Diagrama do princípio da levedura mono-híbrida [2]
Para estudos de híbridos simples/duplos de levedura, a
| Btensão atrial | Microfone (ng/ml) | |
| S. cerevisiae | ATCC9763 (diplóide) | 200-400 |
| SH3328 (haplóide) | 100 | |
| Levedura de saquê (diplóide) | 100-200 | |
| Levedura Shochu (diplóide) | 100 | |
| Levedura de cerveja (triploide ou tetraploide) | 100 | |
| Fermento de padeiro (diplóide) | 200-400 | |
| Esquizofrênico | JY-745 (monoploide) | 100 |
| C. albicans | TIMM-0136 (diplóide) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diplóide) | 80 |
Caso de Aplicação
Para estudar o sítio de ligação da proteína GmWRKY31 no promotor do gene GmSAGT1, no experimento de um híbrido de levedura, a sequência de DNA alvo foi inserida no vetor pBait-AbAi contendo o gene repórter de uracila Ura3, localizado a montante do gene AUR1-C. Após a transformação da levedura com o plasmídeo correspondente, ele foi suspenso em solução de NaCl a 0,9%, e a OD600 foi ajustada para 0,005. Posteriormente, 100 μL da amostra foram espalhados em placas contendo 500 ng/mL de AbA, invertidos e cultivados a 30℃ por 3-5 dias[3].
Figura 3 Interação da proteína GmWRKY31 com cepas de levedura contendo fragmentos F16, F20, F73, delF16, delF20 ou delF73.
Artigos publicados com nossos reagentes
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. O nitrogênio medeia o tempo de floração e a eficiência do uso do nitrogênio por meio de reguladores florais no arroz, Current Biology, Volume 31, Edição 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (SE:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Uma rede reguladora centrada em NnSnRK1 de término precoce da floração induzida pela sombra em lótus, Botânica Ambiental e Experimental, Volume 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (SE:5.7)
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Documentação de referência
[1] Paiano A, et al. Ensaio de dois híbridos de levedura para identificar proteínas interativas.Curr Protoc Protein Sci. 2019 fev;95(1):e70.
[2] John S, et al. Ensaios de levedura híbrida: uma perspectiva histórica e técnica. Métodos. Agosto de 2012; 57 (4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Análise do transcriptoma de TFs WRKY de soja em resposta à infecção por Peronospora manshurica. Genômica. 2019 Dez;111(6):1412-1422.