1 Umprincípio de ação
A higromicina B é um antibiótico aminoglicosídeo produzido pelo metabolismo do Streptomyces hygroscopicus, que inibe a síntese de proteínas ao interromper a translocação e promover a leitura incorreta dos ribossomos 80S, matando assim células procarióticas e eucarióticas.
Atualmente, ele é comumente usado para rastrear e manter células procarióticas ou eucarióticas contendo o gene de resistência à higromicina.
2 Aplicação
2.1 Triagem e manutenção de cultura de células procarióticas ou eucarióticas (células vegetais e células de mamíferos) transfetadas de forma estável com Hph+vetoresA Higromicina B gene de resistência (hyg ou hph) derivado de Escherichia coli. codifica a fosfotransferase de higromicina B, que converte a higromicina B em um produto fosforilado biologicamente inativo, desintoxicando-a. Em vista desse princípio, a higromicina B é um marcador selecionável muito útil para rastrear e manter células procarióticas ou eucarióticas cultivadas transfetadas com sucesso com o gene de resistência à higromicina.
2.2Devido à diferença no modo de ação, a higromicina B é frequentemente usada em combinação com geneticina G418, bleomicina e blasticidina para rastrear linhagens celulares transfetadas de forma estável com dois vetores diferentes.A higromicina B tem um modo de ação diferente do G418 (Cat#60220ES), Bleomicina (Cat#60257ES) e Blasticidinas (Cat#60218ES), por isso é adequado para uso em combinação com outros antibióticos seletivos em experimentos de dupla seleção.
2.3 Agente antiviral2.4 Como anti-helmíntico, é adicionado à ração animal e os animais são criados.
2.5 Triagem de células transfetadas de forma estável
A concentração de trabalho de higromicina B usada para rastrear transfectantes estáveis varia dependendo do tipo de célula, meio, condições de crescimento e taxa metabólica celular. A concentração recomendada é de 50-1000 μg/mL. Para o primeiro uso do sistema experimental, é recomendado que a concentração de triagem ideal seja determinada estabelecendo uma curva de morte, ou seja, uma curva dose-resposta. Em geral, 50-500 μg/mL para células de mamíferos; 20-200 μg/mL para bactérias/células vegetais; 200-1000 μg/mL para fungos.
3 Protocolo
3.1 Preparação da solução de armazenamento (50 mg/mL)
Pese 0,5 g de higromicina B e adicione 10 mL de 1×PBS, pH 7,4. Após a dissolução completa, filtre com um filtro de 0,22 μm para esterilização. Aliquote a solução esterilizada e armazene a -20℃.
3.2 Concentração de triagem comumente usada
A concentração de trabalho de higromicina B para triagem de cepas estáveis varia de acordo com o tipo de célula, meio de cultura, condições de crescimento e taxa metabólica celular. É recomendado estabelecer uma curva de morte (curva dose-resposta), para determinar a concentração de triagem ótima pela primeira vez. Geralmente, células de mamíferos: 50-500 μg/mL; células bacterianas/vegetais: 20-200 μg/mL; fungos: 300-1000 μg/mL.
3.3 Estabelecimento da curva de mortalidade
【Nota】Para rastrear linhas celulares estáveis, é necessário determinar a concentração mínima de antibióticos capazes de matar células hospedeiras não transfectadas. Isso pode ser alcançado estabelecendo uma curva de morte (curva dose-resposta). Pelo menos cinco concentrações devem ser organizadas.
1) Dia 1: As células não transformadas são colocadas em uma placa de cultura apropriada com uma densidade celular de 20-25% e cultivadas durante a noite.【Observação】A quantidade de células de inoculação pode ser aumentada para células que exigem maior densidade para detectar vitalidade.
2) Defina o gradiente de concentração dentro da faixa apropriada de acordo com o tipo de célula. Células de mamíferos podem definir 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Dilua a solução de Higromicina B 1:10 com água deionizada ou tampão PBS para 5 mg/mL. E então dilua a solução para a concentração de trabalho correspondente de acordo com a tabela a seguir.
| Concentração final (μg/mL) | Volume médio (mL) | Volume de adição de 5 mg/mL de Higromicina B (mL) |
| 50 | 9.9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9,5 | 0,5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8,5 | 1.5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) Dia 2: Substituir por um meio recém-preparado contendo a concentração correspondente do fármaco. Faça três amostras paralelas para cada concentração.
4) Substitua por meio novo contendo medicamentos a cada 3-4 dias.
5) Contagens de células vivas são realizadas em um ciclo fixo (por exemplo, a cada 2 dias) para determinar a concentração apropriada para evitar o crescimento de células não transfectadas. Escolha a concentração mínima que mata a maioria das células dentro de um número ideal de dias (geralmente 7-10 dias), como a concentração de trabalho para triagem de linhagem celular estável.
3.4 Triagem de células transfectadas estáveis
1) 48 h após a transfecção, as células foram subcultivadas por meio de triagem contendo higromicina B na concentração apropriada (direta ou diluída). 【Nota】Os antibióticos funcionam melhor em células em divisão ativa. Se as células forem muito densas, o antibiótico não as matará. Divida as células de modo que elas não sejam mais do que 25% confluentes.
2) Troque o meio de triagem a cada 3-4 dias.
3) Meça a formação de colônias de células após 7 dias de triagem. A formação de colônias pode levar outra semana ou mais, dependendo do tipo de célula hospedeira, transfecção e eficácia da triagem.
4) Selecione 5-10 clones resistentes e transfira para placas de cultura de células de 35 mm e cultive em meio de triagem contendo o medicamento por 7 dias.
5) Substituir por meio fresco sem drogas para cultura.
4 Propriedades
A higromicina B é um pó branco a marrom amarelado com um odor especial, facilmente solúvel em água, metanol, etanol, etc., e forma facilmente sais com muitos ácidos orgânicos e inorgânicos.
5 Armazenamento de produtos
A solução pode ser armazenada diretamente a 2~8℃ e pode ser armazenada por mais de 6 meses.
6 Cuidado
1)As células transfectadas com o gene hph são resistentes à higromicina e expressam o gene de forma estável ou temporária.
2) O gene de resistência à higromicina B (hyg ou hph) foi encontrado em outras cepas, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Klebsiella pneumoniae, além de E. Coli.
7 Recomendação de produto
| Nome do produto | Gato# | Especificação |
| Higromicina B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 mL) |
| 60224ES10 | 10×1 g (20 mL) | |
| Higromicina B | 60225ES03 | 1 g |
| 60225ES10 | 10g |
8 Artigos publicados com nossos reagentes
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