Apoptose geralmente se refere a um tipo de morte celular programada que ocorre por meio da regulação de genes intracelulares e seus produtos durante o desenvolvimento das células ou sob a ação de alguns fatores. A apoptose desempenha um papel importante no desenvolvimento embrionário e morfogênese, na estabilidade de populações celulares normais em tecidos, na defesa e resposta imune do corpo, danos celulares e envelhecimento causados ​​por doenças ou envenenamento, e na ocorrência e progressão de tumores, e tem potencial significado terapêutico.

Os eventos na via apoptótica ocorrem em uma sequência temporal, ou seja, os eventos ocorrem em sequência e, eventualmente, levam ao surgimento de corpos apoptóticos, com a ocorrência de apoptose.

Suas características típicas são as seguintes:

1. Apoptose precoce: alterações na estrutura da membrana celular, eversão da fosfatidilserina;

2. Apoptose em estágio inicial e intermediário: a densidade do citoplasma aumentou, o potencial da membrana mitocondrial desapareceu, a permeabilidade mudou e o citocromo C foi liberado no citoplasma;

3. Apoptose tardia: transdução do sinal de apoptose;

4. Apoptose tardia: DNA degradado para fragmentos de 180~200 pb.

Figura 1: Ocorrência e detecção de eventos sequenciais na via de apoptose

1. Apoptose precoce: Anexina-V/PI coloração dupla (detecção de PS na membrana extracelular)

Em células vivas normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada no lado interno da membrana celular. Quando ocorre a apoptose, a membrana celular muda, e a PS muda da superfície interna da membrana celular para a superfície externa da membrana celular. A anexina-V é uma proteína de ligação de fosfolipídios dependente de Ca2+ com um peso molecular de 35-36 KD, que pode se ligar à PS com alta afinidade. Usando a anexina-V marcada com fluoresceína (FITC, Alexa fluor488, etc.) como uma sonda, células apoptóticas e células vivas podem ser identificadas por citometria de fluxo ou microscópio de fluorescência.

PS de células necróticas também irá virar da superfície interna da membrana celular para a superfície externa da membrana celular. A anexina-V também pode reconhecer PS na superfície de células necróticas, então a anexina-V não pode distinguir células necróticas de células apoptóticas. Além disso, o iodeto de propidina (PI) é um corante de ácido nucleico, que pode se ligar ao DNA nas células, e não pode penetrar na membrana celular completa. A membrana celular de células apoptóticas iniciais e células vivas ainda está intacta, e o corante PI não pode entrar na célula livremente através da membrana celular para se ligar ao DNA, então o corante PI não pode marcar células apoptóticas e células vivas, mas o corante PI pode se ligar ao DNA na célula através da membrana celular de células necróticas. O corante PI nas células mortas emitirá fluorescência vermelha após ser excitado pelo laser de 488 nm, e será recebido pelo canal correspondente. Portanto, a anexina V e o PI podem ser usados ​​juntos para distinguir células vivas, células apoptóticas iniciais e células necróticas.

Figura 2: Análise dos resultados da citometria de fluxo após dupla coloração com anexina-v/pi

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2. Apoptose precoce: coloração JC-1 (detecção de alterações no potencial da membrana mitocondrial)

O processo de apoptose é frequentemente acompanhado pela destruição do potencial transmembrana mitocondrial, que é amplamente considerado um dos primeiros eventos no processo da cascata de apoptose. Ocorre antes do aparecimento das características da apoptose nuclear (concentração de cromatina, quebra de DNA). Uma vez que o potencial transmembrana mitocondrial entra em colapso, a apoptose celular é irreversível. A existência do potencial transmembrana mitocondrial permite que alguns corantes fluorescentes catiônicos lipofílicos, como rodamina 123, JC-1, JC-10, se liguem à matriz mitocondrial. O aumento ou diminuição de sua fluorescência indica o aumento ou diminuição da eletronegatividade da membrana interna mitocondrial.

JC-1 é amplamente utilizado para detectar o potencial de membrana mitocondrial △ΨM, mostrando acúmulo dependente de potencial nas mitocôndrias. Em mitocôndrias normais, o JC-1 se agrega na matriz mitocondrial para formar um polímero, que emite forte fluorescência vermelha (ex=585 nm, em=590 nm); Em células apoptóticas, o potencial transmembrana mitocondrial despolarizou, o JC-1 foi liberado da mitocôndria, a concentração diminuiu e reverteu para a forma monomérica emitindo fluorescência verde. Portanto, a mudança de cor reflete diretamente a mudança no potencial da membrana mitocondrial. O grau de despolarização mitocondrial também pode ser medido pela razão entre a intensidade da fluorescência vermelha/verde. A detecção de JC-1 é um método comum.

3. Apoptose tardia: método TUNEL (método de marcação in situ de fragmentos de DNA)

No estágio final da apoptose, um grande número de terminais 3-OH pegajosos são produzidos devido a quebras de fita dupla ou quebras de fita simples do DNA cromossômico. Sob a ação da desoxirribonucleotídeo terminal transferase (TdT), o dUTP marcado com luciferase pode ser ligado ao 3-terminal do DNA, de modo que células apoptóticas podem ser detectadas, tais métodos são chamados de marcação de extremidade de nick de dUTP mediada por desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL). Como células normais ou em proliferação quase não têm quebras de DNA, não há formação de 3-OH e poucas podem ser coradas. O TUNEL é, na verdade, um método de pesquisa que combina biologia molecular e morfologia. A coloração in situ de um único núcleo apoptótico completo ou corpo apoptótico pode refletir com precisão as características bioquímicas e morfológicas típicas da apoptose. Ele pode ser usado para determinar a morfologia celular de cortes de tecido embebidos em parafina, cortes de tecido congelados, células cultivadas e células isoladas de tecidos, e pode detectar um número muito pequeno de células apoptóticas. Portanto, é amplamente utilizado no estudo da apoptose.

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