O princípio de detecção do kit de detecção de apoptose Annexin V-Alexa Fluor488/PI é o seguinte: em células vivas normais, a fosfatidilserina (PS) está localizada no lado interno da membrana celular, mas em células apoptóticas iniciais, a PS vira do lado interno da membrana celular para a superfície da membrana celular e é exposta ao ambiente extracelular. A anexina-V é um Ca²⁺ -proteína de ligação a fosfolipídios dependente de peso molecular de 35 a 36 KD, que se liga com alta afinidade ao PS e se liga à membrana celular de células apoptóticas iniciais por meio da fosfatidilserina exposta na parte externa da célula.
Além disso, o Iodeto de Propídio (PI) é fornecido para distinguir células iniciais sobreviventes de células necróticas ou apoptóticas tardias. O PI é um corante de ácido nucleico, que não pode passar pela membrana celular intacta de células normais ou células apoptóticas precoces, mas pode passar pela membrana celular de células apoptóticas tardias e necróticas e tornar o núcleo vermelho. Assim, quando a Anexina V foi combinada com PI, o PI foi excluído das células vivas (Anexina V^-/PI^-) e células apoptóticas precoces (Anexina V⁺/PI^-). Em contraste, células apoptóticas e necróticas tardias foram duplamente positivas para Alexa Fluor488 e PI (Anexina V⁺/PI⁺).

Componentes do produto

Envio e armazenamento

Os componentes são enviados com uma bolsa de gelo e podem ser armazenados a -20°C por 1 ano.

Cuidados

1) Como a apoptose é um processo rápido, recomenda-se que as amostras sejam analisadas dentro de 1 hora após a coloração.
2) Para células aderentes, a digestão é uma etapa crítica. Não use EDTA na solução digestiva, pois o EDTA pode afetar a ligação da Anexina V ao PS.
3) Se a amostra for de sangue, certifique-se de remover as plaquetas do sangue. Como as plaquetas contêm PS, que pode se ligar à Anexina V, interferindo nos resultados. Um agente tampão contendo EDTA pode ser usado e as plaquetas lavadas por centrifugação a 200 g.
4) Centrifugue o reagente brevemente antes de abrir a tampa e jogue o líquido da parede interna da tampa no fundo do tubo para evitar respingos de líquido ao abrir a tampa.
5) Anexina V-Alexa Fluor488 e PI são substâncias fotossensíveis e devem ser mantidas longe da luz durante o manuseio.
6) Somente para uso em pesquisa!

Instruções

1.1 Amostra de tingimento
1.a) célula de suspensão: As células foram coletadas por centrifugação a 300 g por 5 min a 4°C.
b) célula aderente: Após digestão com tripsina sem EDTA, as células foram coletadas por centrifugação a 300 g por 5 min a 4 °C. O tempo de digestão da tripsina não deve ser muito longo para evitar falsos positivos.
2. As células foram lavadas duas vezes com PBS pré-resfriado a 4 °C, cada vez usando 300 g, e centrifugadas a 4 °C por 5 min.
3. As células foram ressuspensas pela adição de 250 μL de tampão de ligação 1×, e a concentração foi ajustada para 1×106/mL.
4. 100 μL de suspensão de células foram adicionados a um tubo de citometria de fluxo de 5 mL, 5 μL de Anexina V-Alexa Fluor 488 e 10 μL de PI foram adicionados e misturados suavemente.
5. A reação foi mantida longe da luz e mantida em temperatura ambiente por 15 min.
6. 400 μL de tampão de ligação 1× foram adicionados, misturados e as amostras foram detectadas por citometria de fluxo em 1 hora.
[Notas]: Para evitar a perda de células durante a lavagem das células, uma pequena ponta pode ser usada para aspirar o fluido.
1.2 Análise por citometria de fluxo
Alexa Fluor488 tem um comprimento de onda de excitação máximo de 488 nm e um comprimento de onda de emissão máximo de 519 nm; O comprimento de onda de excitação máximo do complexo PI-DNA foi de 535 nm, e o comprimento de onda de emissão máximo foi de 615 nm. CellQuest e outros softwares foram usados ​​para analisar e desenhar um gráfico de pontos de duas cores com Alexa Fluor488 como abscissa e PI como ordenada. Colete 10.000 eventos por amostra.
1.3 Análise por microscopia de fluorescência
1) Pingue uma gota da suspensão de células duplamente corada com Anexina V-FITC/PI na lâmina e cubra as células com uma lamínula.
2) Foi observado sob um microscópio de fluorescência com um filtro de duas cores. O sinal de fluorescência da anexina V-FITC era verde, e o sinal de fluorescência do PI era vermelho.