O kit de detecção de apoptose celular Annexin V-EGFP/PI usa Annexin V marcado com EGFP como uma sonda para detectar a ocorrência de apoptose celular precoce.
O princípio de detecção é o seguinte: em células vivas normais, a fosfotidilserina (PS) está localizada no lado interno da membrana celular, mas em células apoptóticas iniciais, a PS vira do lado interno da membrana celular para a superfície da membrana celular e é exposta ao ambiente extracelular. A anexina-V é um Ca²⁺ -proteína de ligação a fosfolipídios dependente de peso molecular de 35 a 36 kDa que se liga ao PS com alta afinidade. A fosfatidil serina pode se ligar à membrana de células apoptóticas iniciais por meio da fosfatidil serina exposta na parte externa da célula.
Além disso, o Iodeto de Propídio (PI) é fornecido para distinguir células iniciais sobreviventes de células necróticas ou apoptóticas tardias. O PI é um corante de ácido nucleico, que não pode passar pela membrana celular intacta de células normais ou células apoptóticas precoces, mas pode passar pela membrana celular de células apoptóticas tardias e necróticas e tornar o núcleo vermelho. Assim, quando a Anexina V foi combinada com PI, o PI foi excluído das células vivas (Anexina V^-/PI^-) e células apoptóticas precoces (Anexina V⁺/PI^-). As células apoptóticas e necróticas tardias foram duplamente positivas para EGFP e PI (Anexina V⁺/PI⁺).
Este kit é adequado para citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

Componentes do produto

Envio e armazenamento

Os componentes são enviados com uma bolsa de gelo e podem ser armazenados a -20 °C, longe da luz e evitando congelamento e descongelamento repetidos por 1 ano.
[Notas]: Se precisar ser usado repetidamente em um curto período, pode ser armazenado a 4 ℃ e protegido da luz por meio ano.

Cuidados

1) Como a apoptose é um processo rápido, recomenda-se que as amostras sejam analisadas dentro de 1 hora após a coloração.
2) Para células aderentes, a digestão é uma etapa crítica. Não use EDTA na solução digestiva, pois o EDTA pode afetar a ligação da Anexina V ao PS.
3) Anexina V-FITC, mas não a Anexina V-EGFP, deve ser usada para fixar células, como para detectar apoptose e ciclo celular ao mesmo tempo, porque a EGFP seria desnaturada e perderia sua capacidade de excitar fluorescência durante a fixação. As células foram incubadas com Anexina V-FITC antes da fixação e a Anexina V-FITC não ligada foi lavada com Tampão de Ligação.Porque o aumento da permeabilidade celular durante a fixação cria resíduos celulares que podem se ligar à Anexina V e interferir nos resultados.
4) Se a amostra for de sangue, certifique-se de remover as plaquetas do sangue. Porque as plaquetas contêm PS, que pode se ligar à Anexina V, interferindo nos resultados. As plaquetas podem ser lavadas usando um agente tamponante contendo EDTA e centrifugando a 200 g.
5) Centrifugue o reagente brevemente antes de abrir a tampa e jogue o líquido da parede interna da tampa no fundo do tubo para evitar respingos de líquido ao abrir a tampa.
6) Anexina V-EGFP e PI são substâncias fotossensíveis, portanto, evite a luz durante a operação.
7) Somente para uso em pesquisa!

Instruções

Desenho experimental
Tubo em branco: células de controle negativo sem Anexina V-EGFP e solução de coloração PI foram usadas para regulação de voltagem.
Tubos com coloração única: células de controle positivo, suplementadas apenas com Anexina V-EGFP, foram usadas para modular a compensação.
Tubo de detecção: As células foram tratadas com Annexin V-EGFP e PI Staining Solution. Os dados experimentais foram obtidos ajustando os parâmetros do tubo em branco e do tubo de corante único.
1.1 Tingimento de amostra
1) célula de suspensão: As células foram coletadas por centrifugação a 300 g por 5 min a 4 °C.
célula aderente: Após digestão com tripsina sem EDTA, as células foram coletadas por centrifugação a 300 g por 5 min a 4 °C. O tempo de digestão da tripsina não deve ser muito longo para evitar falsos positivos.
2) As células foram lavadas com PBS pré-resfriado duas vezes, cada vez a 300 g, e centrifugadas a 4 ℃ por 5 min.
3) As células foram ressuspensas com tampão de ligação 1× e a concentração foi ajustada para 1~5 ×106/mL.
4) 100 μL de suspensão de células foram adicionados em tubos de citometria de fluxo de 5 mL, 5 μl de Anexina V-EGFP foram adicionados e as células foram misturadas e incubadas por 5 min em temperatura ambiente sob luz.
5) Adicionando 10 μl de solução PI e 400 μl de PBS, a coloração foi realizada imediatamente.
[Notas]: Ao usar citometria de fluxo para detectar apoptose, o PI é bastante afetado pelo tempo, e muito tempo levará a um aumento na coloração do PI, portanto a citometria de fluxo deve ser concluída em 1 hora.
1.2 Análise por citometria de fluxo
O comprimento de onda máximo de excitação do EGFP foi de 488 nm, e o comprimento de onda máximo de emissão foi de 507 nm; O comprimento de onda máximo de excitação do complexo PI-DNA foi de 535 nm, e o comprimento de onda máximo de emissão foi de 615 nm. Um software como o CellQuest foi usado para análise e um gráfico de pontos de duas cores foi desenhado, EGFP é a abscissa e PI é a ordenada. Colete 10.000 eventos por amostra. Em um experimento típico, as células podem ser divididas em três subgrupos, células vivas têm apenas fluorescência de fundo de intensidade muito baixa, células apoptóticas iniciais têm apenas fluorescência verde forte e células apoptóticas tardias têm coloração dupla de fluorescência verde e vermelha.