Quando as células sofrem apoptose, elas ativam enzimas endonuclease que cortam o DNA genômico entre os nucleossomos. A escada de DNA de 180-200 pb foi detectada por eletroforese após extração de DNA durante a apoptose.
O kit de detecção de apoptose TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 488) pode ser usado para detectar fragmentação de DNA nuclear no processo apoptótico tardio de células de tecido. O princípio é que sob a ação da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 488-12-DUTP é incorporado ao Terminal 3´ -hidroxil (3´-OH) exposto durante a quebra do DNA genômico. Assim, ele pode ser detectado por microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo.
O corante Alexa Fluor 488 é mais estável e tem um sinal mais forte, resultando em marcadores mais brilhantes e maior resistência à têmpera.
Este kit tem uma ampla gama de aplicações e pode ser usado para detectar apoptose em cortes congelados ou em parafina, bem como em células aderentes ou suspensas cultivadas.

Componentes do produto

Envio e armazenamento

Os componentes são enviados com uma bolsa de gelo e podem ser armazenados a -20°C por 1 ano.

Cuidados

1. É necessário preparar seu próprio PBS para lavar as células, uma solução de extinção antifluorescência para selar os comprimidos e 4% de paraformaldeído para fixação.

2. Somente para uso em pesquisa!

Instruções

1. A preparação da amostra
1.1 Secções de tecido embebidas em parafina
1.1.1. As seções de tecido de parafina foram imersas em xileno por 5 minutos em temperatura ambiente e repetidas uma vez para remover completamente a parafina.
1.1.2. Mergulhe as seções em etanol 100% por 5 minutos em temperatura ambiente e repita uma vez.
1.1.3. À temperatura ambiente, as amostras foram embebidas com etanol gradiente (90, 80, 70%) por 3 min de cada vez.
1.1.4. Enxágue as seções suavemente com PBS e seque cuidadosamente o excesso de líquido ao redor da amostra nas lâminas de vidro com papel de filtro. Neste caso, a caneta de parafina ou caneta hidrofóbica pode ser usada para desenhar o contorno da distribuição da amostra ao redor da amostra, o que é conveniente para o processamento de permeabilidade a jusante e operação de rotulagem de equilíbrio. Não deixe a amostra secar durante o experimento. Coloque a amostra processada na caixa úmida para mantê-la úmida.
1.1.5.2 mg/mL de solução de Proteinase K foi diluída com PBS na proporção de 1:100 para atingir uma concentração final de 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL de solução de Proteinase K na concentração de 20 μg/mL foram adicionados a cada amostra para cobri-la completamente e incubados em temperatura ambiente por 20 min.
[Notas]: A proteinase K ajuda tecidos e células a se tornarem permeáveis ​​aos reagentes de coloração em etapas subsequentes. Um tempo de incubação muito longo aumentará o risco de cortes de tecido caírem da placa transportadora em etapas de lavagem subsequentes, enquanto um tempo de incubação muito curto pode causar tratamento de permeabilidade insuficiente e afetar a eficiência da marcação. Para obter melhores resultados, pode ser necessário otimizar o tempo de incubação da proteinase K.
1.1.7.Enxágue a amostra 2-3 vezes com solução PBS, remova delicadamente o excesso de líquido e seque cuidadosamente o líquido ao redor da amostra na lâmina com papel de filtro. A amostra processada é colocada em uma caixa molhada para manter a amostra úmida.
1.2 Seção congelada de tecido
1.2.1. Remova as seções congeladas e retorne à temperatura ambiente. As lâminas foram imersas em solução de paraformaldeído a 4% (dissolvida em PBS) e fixadas e incubadas por 30 min à temperatura ambiente.
1.2.2. Remova cuidadosamente o excesso de líquido e use papel de filtro para secar cuidadosamente o excesso de líquido ao redor da amostra na lâmina de vidro.
1.2.3. As lâminas foram imersas em solução de PBS, incubadas em temperatura ambiente por 15 min e lavadas com PBS novamente 2 vezes no total.
1.2.4. Remova cuidadosamente o excesso de líquido e seque cuidadosamente a lâmina de vidro com papel de filtro para remover o excesso de líquido ao redor da amostra. Neste caso, a caneta de parafina ou caneta hidrofóbica pode ser usada para desenhar o contorno da distribuição da amostra ao redor da amostra, o que é conveniente para o processamento de permeabilidade a jusante e operação de rotulagem de equilíbrio. Durante o experimento, não deixe a amostra secar e coloque a amostra processada na caixa molhada para mantê-la molhada.
1.2.5. A solução de Proteinase K de 2 mg/mL foi diluída com PBS na proporção de 1:100 para atingir uma concentração final de 20 μg/mL.
1.2.6. 100 μL de solução de Proteinase K na concentração de 20 μg/mL foram adicionados a cada amostra para cobri-la completamente e incubados em temperatura ambiente por 10 min.
[Notas]: A proteinase K ajuda tecidos e células a serem permeáveis ​​aos reagentes de coloração em etapas subsequentes. Um tempo de incubação muito longo aumentará o risco de cortes de tecido caírem da placa transportadora em etapas de lavagem subsequentes, enquanto um tempo de incubação muito curto pode causar tratamento de permeabilidade insuficiente e afetar a eficiência da marcação. Pode ser necessário otimizar o tempo de incubação da proteinase K se melhores resultados não forem obtidos.
1.2.7. Enxágue a amostra 2-3 vezes em um béquer aberto contendo solução de PBS.
[Notas]: Para evitar a perda de descamação da amostra na etapa de limpeza, é recomendável não lavar o frasco, mas mergulhar as lâminas de vidro na solução PBS 2 a 3 vezes para limpeza.
1.2.8. Remova cuidadosamente o excesso de líquido e use papel de filtro para secar cuidadosamente o líquido ao redor da amostra na lâmina.A amostra processada é colocada em uma caixa úmida para preservar a umidade da amostra.
1.3 Preparação da folha de rastreamento celular
As células aderentes foram cultivadas em Lab-Tek of Chamber Slides. Após o tratamento de indução de apoptose, as lâminas foram lavadas duas vezes com PBS.
1.4 Preparação de esfregaços de células (tomando como exemplo lâminas revestidas com polilisina)
1.4.1. As células foram ressuspensas em PBS a uma concentração de cerca de 2 × 107 células/mL, 50-100 μL da suspensão celular foram aspirados em lâminas revestidas com polilisina, e a suspensão celular foi gentilmente aberta com uma lâmina limpa.
1.4.2. As células foram fixadas, e as lâminas foram imersas em um tanque de coloração contendo 4% de paraformaldeído recém-preparado em PBS e colocadas a 4 ° C por 25 min.
1.4.3. As lâminas foram lavadas, imersas em PBS e deixadas em temperatura ambiente por 5 min. Lavar novamente com PBS.
1.4.4. Remova cuidadosamente o excesso de líquido e seque cuidadosamente a lâmina de vidro com papel de filtro para remover o excesso de líquido ao redor da amostra. Neste caso, uma caneta de parafina ou caneta hidrofóbica pode ser usada para delinear a distribuição da amostra ao redor da amostra para facilitar o processamento de permeabilidade a jusante e as operações de rotulagem de equilíbrio. Durante o experimento, não deixe a amostra secar e coloque a amostra processada na caixa úmida para mantê-la úmida.
1.4.5. A solução de Proteinase K de 2 mg/mL foi diluída com PBS na proporção de 1:100 para atingir uma concentração final de 20 μg/mL.
1.4.6. 100 μL de solução de Proteinase K na concentração de 20 μg/mL foram adicionados a cada amostra para cobri-la completamente e incubados em temperatura ambiente por 5 min (também podem ser imersos em solução de Triton X-100 a 0,2% preparada em PBS e incubados em temperatura ambiente por 5 min para tratamento de permeabilidade).
[Notas]: A proteinase K ajuda tecidos e células a serem permeáveis ​​aos reagentes de coloração em etapas subsequentes. Um tempo de incubação muito longo aumentará o risco de cortes de tecido caírem da placa transportadora em etapas de lavagem subsequentes, enquanto um tempo de incubação muito curto pode causar tratamento de permeabilidade insuficiente e afetar a eficiência da marcação. Pode ser necessário otimizar o tempo de incubação da proteinase K se melhores resultados não forem obtidos.
1.4.7. Enxágue a amostra 2-3 vezes com PBS, remova delicadamente o excesso de líquido e seque cuidadosamente o líquido ao redor da amostra na lâmina com papel de filtro. As amostras processadas foram colocadas em uma caixa úmida.
2. Etapas para o tratamento de DNase de controles positivos
Após a permeação da amostra, as células foram tratadas com DNase I para preparar lâminas de controle positivo. Este processo geralmente faz com que a maioria das células tratados para mostrar fluorescência verde.
[Notas]: O tratamento com Dnase I de células imobilizadas causa a quebra do DNA cromossômico, produzindo muitas extremidades 3' do DNA que podem ser marcadas.
2.1. Diluir 10 × DNase I Buffer com água deionizada na proporção de 1:10 (200 µL 1× DNase I Buffer são necessários para cada amostra, ou seja, 20 µL 10 × DNase I Buffer e 180 µL de água deionizada são necessários para diluição). Uma gota de 100 µl foi adicionada à amostra permeável e incubada por 5min em temperatura ambiente. Adicionar 1 μL de DNase I (1U/μL) aos 100 μL restantes de 1 × DNase I Buffer para atingir uma concentração final de 10 U/mL.
2.2. O líquido foi suavemente batido e, em seguida, 100 μL de tampão contendo 10 U/mL de DNase I foram adicionados e incubados por 10 min em temperatura ambiente.
2.3. Bata levemente na lâmina para remover o excesso de líquido e lave-a cuidadosamente 3 a 4 vezes em um tanque de corante com água deionizada.
[Notas]: Um tanque de coloração separado deve ser usado para as lâminas de controle positivo, caso contrário, a DNase I residual nas lâminas de controle positivo pode introduzir um alto nível de fundo nas lâminas experimentais.
3. Rotulagem e Detecção
3.1.O tampão de equilíbrio (5 × tampão de equilíbrio) é diluído com água deionizada na proporção de 1:5 (100 μL de tampão de equilíbrio 1 × são necessários para cada amostra).
3.2. Tampão de equilíbrio (100 μL 1× Tampão de equilíbrio) foi adicionado a cada amostra para equilibrar completamente a área e incubado por 10-30 min em temperatura ambiente. Alternativamente, deslize para um VAT com 1 x Tampão de equilíbrio para garantir que as lâminas estejam equilibradas. Descongele a Mistura de rotulagem Alexa Fluor 488-12-DUTP no gelo enquanto equilibra as células e prepare tampão de incubação TdT suficiente para todos os experimentos e reações de controle positivo opcionais de acordo com a Tabela 1. Para uma reação padrão com uma área de menos de 5 cm2, o volume é 50 μl, e 50 μl são multiplicados pelo número de reações experimentais e de controle positivo para determinar o volume total de tampão de incubação TdT necessário. Para amostras com áreas de superfície maiores, o volume do reagente pode ser aumentado proporcionalmente.

Tabela 1 Tampões de incubação TdT preparados para experimentos e reações de controle positivo opcionais

[Sistema de controle negativo]: Um tampão de incubação de controle sem enzima TdT foi preparado e a enzima TdT foi substituída por ddH2O.
3.3. A maior parte dos 100 μl de tampão de equilíbrio 1× foi lavada com papel absorvente ao redor da área equilibrada e, em seguida, 50 μl de tampão de incubação TdT foram adicionados a uma área de 5 cm2 de células. Não deixe as células secarem. Depois disso, a lâmina deve ser protegida da luz.
3.4. Coloque uma lamínula de plástico sobre as células para garantir uma distribuição uniforme dos reagentes e coloque uma toalha de papel umedecida com água no fundo da caixa úmida. As lâminas foram colocadas em uma caixa úmida e incubadas a 37 ℃ por 60 min. Enrole a caixa úmida em papel alumínio para protegê-la da luz.
[Notas]: O vidro de cobertura de plástico pode ser cortado ao meio antes do uso. Dobre a borda do vidro de cobertura para fácil remoção e manipulação.
3.5. As lamínulas de plástico foram removidas, e as seções foram incubadas em solução de PBS em temperatura ambiente por 5 min. Então as seções foram lavadas duas vezes com PBS fresco.
3.6. Limpe suavemente a solução PBS ao redor e na parte de trás da amostra com papel de filtro.
[Notas]: Para reduzir o fundo, após lavar as lâminas com PBS uma vez, elas podem ser lavadas com PBS contendo 0,1% de Triton X-100 e 5 mg/mL de BSA 3 vezes, 5 minutos cada vez, para que os marcadores livres que não reagiram possam ficar claros e limpos.
3.7. As amostras foram coradas em um tanque de coloração, e as lâminas foram imersas em um tanque de coloração contendo solução de PI (1 μg/mL, recém-preparada e diluída com PBS) no escuro e deixadas em temperatura ambiente por 5 min. (Opcional): As amostras foram coradas em um tanque de coloração, e as lâminas foram imersas em um tanque de coloração contendo solução de DAPI (2 μg/mL, recém-preparada e diluída com PBS) no escuro e deixadas em temperatura ambiente por 5 min.
3.8.Lave a amostra, mergulhe a lâmina em água deionizada e deixe em temperatura ambiente por 5 minutos. Repita duas vezes para um total de três lavagens.
3.9. O excesso de água na lâmina foi seco e 100 μl de PBS foram adicionados à área da amostra para mantê-la úmida.
3.10. As amostras foram imediatamente analisadas sob um microscópio de fluorescência, e a fluorescência verde foi observada a 520±20 nm com um dispositivo de filtro de fluorescência padrão. A fluorescência vermelha do PI foi observada a > 620 nm, ou o DAPI azul foi observado a 460 nm. Se necessário, as lâminas podem ser armazenadas durante a noite a 4 °C no escuro.
[Notas]: PI/DAPI pode colorir células apoptóticas e não apoptóticas de vermelho/azul, e somente em núcleos apoptóticos o Alexa Fluor 488-12-DUTP foi incorporado e fluorescência verde localizada.
4. As células em suspensão foram detectadas por citometria de fluxo
4.1. 3~5 × 106 células foram lavadas duas vezes com PBS por centrifugação (300 × g) a 4 ° C, centrifugadas a 300 g a 4 ° C por 10 min e então ressuspensas em 0,5 mL de PBS.
4.2. As células foram fixadas e 5 mL de solução de paraformaldeído a 1% preparada em PBS foram adicionados e colocados no gelo por 20 min.
4.3. As células foram centrifugadas a 300 × g a 4 °C por 10 min, e o sobrenadante foi removido e ressuspenso em 5 mL de PBS. A lavagem foi repetida uma vez e as células foram ressuspensas com 0,5 mL de PBS.
4.4. As células foram permeadas, e 5 mL de etanol 70% pré-resfriado com gelo foram adicionados e incubados a -20 °C por 4 horas. As células poderiam ser armazenadas em etanol 70% a -20℃ por uma semana, ou as células poderiam ser permeáveis ​​com solução de Triton X-100 0,2% preparada em PBS e armazenadas em temperatura ambiente por 5 min.
4.5. As células foram centrifugadas a 300 × g por 10 min e ressuspensas em 5 mL de PBS. A centrifugação foi repetida e ressuspensas em 1 mL de PBS.
4.6. Transfira 2×106 células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4.7. O equilíbrio foi centrifugado a 300×g por 10 min, e o sobrenadante foi removido e ressuspenso com 80 μL de 1×Equilibration Buffer. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
4.8. Durante o balanceamento das células, o Alexa Fluor 488-12-DUTP Labeling Mix foi derretido em gelo, e tampão de incubação TdT suficiente para todas as reações foi preparado de acordo com a Tabela 1. Para uma reação padrão de 2×106 células, o volume é 50 μL, e 50 μL vezes o número de reações é o volume total de tampão de incubação TdT necessário.
4.9. As células foram centrifugadas a 300×g por 10 min, o sobrenadante foi removido e o precipitado foi ressuspenso em 50μL de tampão de incubação TdT e incubado a 37℃ por 60 min, protegido da luz. As células foram ressuspensas suavemente a cada 15 min com uma micropipeta.
4.10. A reação foi encerrada pela adição de 1 mL de EDTA 20 mM e misturando suavemente com uma micropipeta.
4.11. Após centrifugação a 300g por 10 min, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em 1 mL de solução de Triton X-100 0,1% preparada em PBS, contendo 5 mg/mL de BSA. A solução foi repetida uma vez e lavada duas vezes no total.
4.12. O sobrenadante foi descartado por centrifugação a 300 g por 10 min, e as células foram ressuspensas em 0,5 mL de solução 5μg/mLPI recém-preparada com PBS, que continha 250 μg de RNase A livre de DNase.
4.13. As células foram incubadas no escuro por 30 min em temperatura ambiente.
4.14. As células foram analisadas por citometria de fluxo, e a fluorescência verde foi observada a 520±20 nm. A fluorescência vermelha do PI foi observada a > 620 nm. O PI pode manchar células apoptóticas e não apoptóticas de vermelho, e somente em núcleos apoptóticos o Alexa Fluor 488-12-DUTP foi incorporado e a fluorescência verde localizada.