1. O que são células dendríticas (DC)?
As células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras de antígenos (APCs) mais eficazes no corpo humano. As DCs são as únicas APCs capazes de estimular de forma robusta a proliferação de células T ingênuas. Outros tipos de APC (como monócitos, macrófagos, células B, etc.) podem estimular apenas células T ativadas ou de memória. Portanto, as células DC são as iniciadoras das respostas imunes adaptativas das células T e desempenham um papel extremamente importante na imunidade tumoral. As células DC expressam altamente moléculas MHC-I e MHC-II em sua superfície e têm marcadores de superfície específicos. Elas absorvem, processam e estimulam as células T para ativar antígenos e, finalmente, determinam a direção de diferenciação das células T.
2. Fonte de DC
As células DC estão presentes em quantidades muito pequenas no corpo. Leva muito tempo para isolar diretamente as DC do corpo e o rendimento celular é muito baixo, o que limita muito a pesquisa e a aplicação das DC. No entanto, as DC podem ser diferenciadas e induzidas a partir de células precursoras de DC em diferentes tecidos, como células precursoras no fluido da medula óssea, monócitos no sangue periférico e sangue do cordão umbilical.
Para humanos, como o sangue periférico humano é o mais conveniente de se obter e tem o maior número de monócitos, o método mais comumente usado é induzir DC a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC). Para camundongos, o método mais comum é induzir DC a partir de células da medula óssea, ou seja, células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC).
Figura 1. Diagrama esquemático do método clássico de preparação de BMDC
3. Método de preparação BMDC
Métodos comuns para preparar BMDCs de camundongos são:
3.1 Método clássico de cultura BMDC - Método Inaba (modificado)
3.2 Preparação em larga escala do método BMDC - Sons
3.3 Preparação em larga escala do método BMDC - Lutz
3.1 [Método clássico de cultura BMDC] - Método Inaba (melhorado)
【Fundo】
um. O número de BMDCs obtidos pelo método Inaba é 5-7 x 106/rato;
b. O método Inaba original usa apenas GM-CSF para induzir a produção de BMDCs. Embora os BMDCs obtidos tenham uma forte capacidade estimulante na reação de linfócitos mistos, a maturidade das DCs não é tão boa quanto a da indução combinada de GM-CSF+IL-4. Portanto, o método aprimorado subsequente geralmente usa a indução combinada de GM-CSF+IL-4.
【Etapas de cultivo】
3.1.1 Obtenção de células da medula óssea do rato
1) Camundongos (6 a 10 semanas de idade) foram mortos por deslocamento cervical, todos os fêmures e tíbias foram removidos cirurgicamente, e o tecido muscular ao redor dos ossos foi removido o máximo possível com tesouras e fórceps.
[Observação] Não danifique os ossos.
2) Mova o osso para a bancada limpa e deixe-o de molho em uma placa de cultura estéril contendo álcool 70% por 2 a 5 minutos para desinfetar e esterilizar. Depois, lave-o duas vezes com PBS estéril.
3) Mova o osso para outra nova placa de cultura contendo PBS, corte as duas pontas do osso com uma tesoura e, em seguida, use uma seringa para extrair o PBS. Insira a agulha na cavidade da medula óssea de ambas as pontas do osso e lave repetidamente a medula óssea na placa de cultura até que o osso fique completamente branco.
4) Colete a suspensão de medula óssea e filtre pequenos fragmentos e tecido muscular com uma malha de náilon de 200 mesh.
5) Centrifugar o filtrado a 1200 rpm para 5 minutos e descarte o sobrenadante.
6) Adicione 2 ml de tampão de lise de hemácias de cloreto de amônio (1x), ressuspenda as células e incubar em temperatura ambiente por 3-5 minutos, até 10 mínimo
7) Adicione 10 ml de PBS para neutralizar o efeito do tampão de lise e centrifugue a 1200 rpm por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
8) Lave uma vez com PBS e, em seguida, ressuspenda as células em meio de cultura RPMI1640 contendo 10% de FBS. Células de medula óssea de camundongo foram obtidas.
Preparação da solução de lise de hemácias com cloreto de amônio:
um. Prepare a solução de armazenamento 10x da seguinte forma: pese 82,9 gNH4Cl, 10,0g KHCO3 e 0,37g Na2EDTA, dissolver em 1L de água destilada, filtrar com 0,22 Membrana de filtro μm para esterilizar e armazenar a 4℃ por 6 meses;
b. Antes de usar, dilua a solução de armazenamento 10x com água destilada estéril 1:9 para 1x solução de trabalho.
[Observação] Como a solução de lise de hemácias com cloreto de amônio tem um certo efeito prejudicial nas células da medula óssea, o tempo de hemólise deve ser reduzido o máximo possível.
3.1.2 Indução da diferenciação de BMDC
1) Conte as células da medula óssea do camundongo obtidas na etapa 1 e ajuste a concentração de células para 0,5-1× 106/ml com meio de cultura completo RPMI 1640 contendo 10% de SFB.
2) Coloque em uma placa de cultura de 24 poços, 1 ml de células por poço, adicione GM-CSF de camundongo recombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml), e cultura em 37℃, 5% CO2 incubadora. Este é o 0º dia de cultura.
【Observação】
um. Geralmente, cerca de 4-5x107 células da medula óssea podem ser coletadas de um camundongo, então pelo menos 40-50 poços de uma placa de 24 poços podem ser semeados.
b. As faixas de concentração de GM-CSF e IL-4 são 20-50 ng/ml e 10-40 ng/ml, respectivamente.
3) Agite suavemente a placa de cultura a cada 2 dias e, em seguida, substitua 3/4 do volume com meio de cultura novo e reponha as citocinas.
4) Entre o 5º e o 8º dia, sopre suavemente o meio de cultura para coletar células suspensas e células frouxamente aderidas.
5) Centrifugar a 1200 rpm para 5 minutos e descarte o sobrenadante.
6) Ressuspenda as células em meio de cultura completo RPMI 1640 contendo 10% de SFB e conte-as, depois ajuste a concentração de células para 1×106/ml e adicionar GM-CSF de camundongo recombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml).
7 ) Coloque as células em placas de cultura de 100 mm (até 10 ml por placa) ou em placas de cultura de 6 poços (2 m/poço).
8) Continue a cultura em 37℃, 5% de CO2 incubadora por 1-2 dias.
9) Colete as células suspensas, que são as BMDCs mais maduras.
【Observação】
um. As etapas 2.5 a 2.8 são etapas de replicação, cujo objetivo é tornar o BMDC obtido na etapa 2.4 mais maduro.
b. Dentro de 3 horas após a replaqueamento, muitas células aderentes espinhosas podem ser vistas migrando dos aglomerados de DC e, após 1 dia de cultura, essas células aderentes serão encontradas destacadas do fundo da placa de cultura, e muitas DCs típicas podem ser vistas flutuando no meio de cultura.
3.1.3 Maturação completa do BMDC
[Nota] Os BMDCs obtidos na etapa 2 não são DCs totalmente maduros. Se você quiser obter DCs totalmente maduros, você ainda precisa ser induzido por LPS, CD40L ou TNF-a.
1) Centrifugar o BMDC obtido na etapa 2.4 ou 2.9 a 1200 rpm para 5 minutos e descarte o sobrenadante.
2) Ressuspenda o precipitado com meio de cultura completo RPMI contendo GM-CSF de camundongo recombinante (20 ng/ml) e IL-4 (10 ng/ml), e ajuste a concentração da célula para 1×106/ml após a contagem.
3) Adicione em placas de cultura de 24 poços e adicione indutores de maturação, como TNF-α (250 U/mL), LPS (1 μg/mL) ou CD40L (1 (μg/mL).
4) Cultura em 37℃, 5% CO2 incubadora por 2 dias.
5) Colete as células suspensas e as células que crescem frouxamente presas à parede, que são células dendríticas maduras.
3.2【Método de produção em massa BMDC】-Método filho
【Fundo】
um. Este método pode obter 30-40×106 DC/camundongo em 7 dias, o que é 7-10 vezes maior que o método clássico Inaba. Após a DC ser centrifugada através de gradiente de metrizamida de 14,5%, a pureza (ou seja, células CD11c+/I-Ab+) pode atingir 85-95%.
b. A capacidade de endocitose das DC obtidas por este método é mais fraca que a do método clássico de Inaba, mas a quantidade de IL-12p70 secretada é semelhante.
c. As DC obtidas por este método têm maior capacidade de estimulação na reação de linfócitos mistos do que o método clássico de Inaba.
e. As DC obtidas por esse método podem induzir uma resposta mais forte das células T específicas.
e. Em resumo, o método Son pode obter BMDC mais maduros do que o método clássico.
【Etapas de cultivo】
3.2.1 Obtenção de células da medula óssea do rato
Veja os passos correspondentes no método Inaba (modificado).
3.2.2 Preparação de grandes quantidades de BMDC
1) Conte as células da medula óssea do camundongo obtidas na etapa 1 e ajuste a concentração de células para 2×105/ml com meio de cultura completo RPMI 1640 contendo 10% de SFB.
2) Espalhe em placas de cultura de 6 poços, 5 ml de células por poço, adicione GM-CSF de camundongo recombinante (1000 U/mL) e IL-4 (1000 U/mL), e cultura em 37℃, 5% CO2 incubadora.
3) No 4º dia de cultura, suplementar o sistema de cultura com GM-CSF de camundongo recombinante (1000 U/mL) e IL-4 (1000 U/mL).
4) Coletar DCs no 7º dia de cultura, ressuspender com 2-4 ml de meio de cultura completo RPMI 1640, adicionar um volume igual de 14,5% (p/v) de mepanema e centrifugar em temperatura ambiente por 20 mínimo a 1200xg.
5) Colete a camada do meio e lave-a três vezes com meio de cultura completo RPMI 1640 para uso posterior.
[Observação] O DC neste ponto é um BMDC imaturo. Se você quiser amadurecê-lo ainda mais, pule para a etapa 3.
3.2.3 Maturidade plena do BMDC
1) Re-plaqueou os BMDCs coletados na etapa 2.4 e adicionou GM-CSF de camundongo recombinante (1000 U/mL) e IL-4 (1000 U/mL), bem como LPS (1-10 μg/mL) para o sistema cultural
2) Cultivado em 37℃, 5% CO2 incubadora por 2 dias para obter BMDCs maduros.
3.3【Método de preparação de massa BMDC】-Método Lutz
【Fundo】
um. O método Lutz é semelhante ao método Son, e ambos os métodos podem preparar BMDC em grandes quantidades, mas o método Lutz é mais amplamente utilizado que o método Son.
b. Este método pode obter mais BMDC, até 1-3 x 108 DC/mouse, e a pureza pode atingir 90-95%;
c. A concentração de citocina usada neste método é muito menor do que a do método Son, apenas 200 U/mL, e cai para 30-100 U/mL do 8º ao 10º dia de cultura, o que pode economizar muito o custo do reagente;
e. A maior diferença entre este método e o método clássico de Inaba e o método Son é que as células da medula óssea são cultivadas em uma placa de cultura bacteriana (placa de Petri) em vez de uma placa de cultura celular. Inaba explicou que a placa de cultura bacteriana não é fácil para os macrófagos na medula óssea aderirem à parede, inibindo assim o desenvolvimento de macrófagos e evitando o efeito inibitório dos macrófagos na maturação de DC. Esta pode ser a principal razão pela qual este método pode obter um grande número de BMDCs em uma densidade de plaqueamento mais baixa.
e. No entanto, o tempo de cultura deste método é relativamente longo, exigindo 10-12 dias. Por um lado, isso é para obter mais BMDCs. Por outro lado, a maioria dos granulócitos e linfócitos são difíceis de sobreviver por tanto tempo, então a pureza dos BMDCs finalmente obtidos pode ser melhorada;
e. Este método usa apenas GM-CSF para cultura de indução, e os BMDCs obtidos contêm DCs imaturas e maduras. Para melhorar ainda mais a maturidade, LPS ou TNF-α precisam ser usados por mais 1-2 dias de indução, e o conteúdo de células DC maduras atingirá 50-70%.
【Etapas de cultivo】
3.3.1 Obtenção de células da medula óssea de camundongo
Veja as etapas correspondentes no método Inaba (modificado) e observe que a etapa de hemólise deve ser omitida.
3.3.2 Preparação em larga escala de BMDC
1) Conte as células da medula óssea do camundongo obtidas na etapa 1 e ajuste a concentração de células para 2×105/ml com meio de cultura completo RPMI 1640 contendo 10% de SFB;
2) Espalhe em placas de cultura bacteriana de 100 mm (placa de Petri), 10 ml de células por placa e adicione GM-CSF de camundongo recombinante (200 U/mL), e cultura a 37℃, 5% de CO2 em incubadora;
[Observação] Placas de cultura bacteriana são usadas aqui, não placas de cultura de células.
3) No 3º dia, adicionar 10ml de meio de cultura completo contendo 20 ng/ml GM-CSF de camundongo recombinante para a placa de cultura;
4) No 6º e 8º dias, trocar metade do meio, ou seja, coletar o meio de cultura antigo, ressuspender o pellet celular com meio de cultura completo contendo 20 ng/ml GM-CSF de camundongo recombinante após centrifugação e, em seguida, colocar a suspensão de células de volta na placa original;
5) No 10º dia, as células podem ser coletadas, que são as BMDCs.
3.3.3 Maturação completa dos BMDCs
1) Coletar as células suspensas soprando suavemente as DCs no 10º dia de cultura com uma pipeta e centrifugar a 300xg por 5 minutos em temperatura ambiente;
2) Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet de células com 10 ml de meio de cultura completo RPMI 1640 e, em seguida, espalhe-o em uma placa de cultura de células de 100 mm;
3) Adicionar GM-CSF de camundongo recombinante (100 U/mL) e TNF-α (500 U/mL), ou GM-CSF de camundongo recombinante (100 U/mL) e LPS (1 (μg/mL);
4) Continue a cultura em 37℃, 5% de CO2 incubadora por 1-2 dias.
4. Identificação de BMDCs
eu Observação morfológica: A maioria dos BMDCs cresce em colônias, e as células têm múltiplas saliências dendríticas, que são mais óbvias em BMDCs maduros.
eu Análise do fenótipo celular: A citometria de fluxo foi usada para detectar a expressão de moléculas CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC classe II (IA/IE) na superfície de células DC. BMDCs expressam altamente essas moléculas, e a expressão dessas moléculas em BMDCs totalmente maduras será ainda mais aumentada.
eu Reação linfocitária mista (MLR): os BMDCs têm forte capacidade estimulatória e, quanto maior a maturidade, mais forte é a capacidade estimulatória.
5. Como escolher um indutor de maturação?
LPS, CD40L e TNF-α são comumente usados e indutores de maturação eficazes para DC humana e DC de camundongo. TNF-a tem a capacidade mais fraca de induzir a maturação de DC entre os três. LPS e CD40L são ambos indutores fortes para a maturação completa de DC in vitro. A maturação de DC induzida por ambos é semelhante, mas o espectro de citocina induzida é diferente. BMDC madura induzida por CD40L mostra a capacidade imunorregulatória mais forte in vivo, incluindo a geração de respostas imunes tumorais protetoras e terapêuticas. A concentração usada para estimular a maturação completa de DC com LPS é geralmente 1-10 μg/mL, mas na verdade 0,1 μg/mL tem um efeito muito forte, mas para fins de seguro, 1 μg/mL é geralmente usado. Deve-se notar que as moléculas CD40L pertencem à família de ligantes TNF, que é caracterizada pelo fato de que elas só podem funcionar após a formação de trímeros. Portanto, é melhor usar a proteína trímera CD40L recombinante para estimular DC, o que terá um bom efeito. Se os monômeros CD40L forem usados para estimular DC, a maturidade não é muito alta na maioria dos casos.
6. Escolha do método de treinamento
Tabela 1.Comparação de três métodos experimentais comuns para preparação de BMDC
| Parâmetro | Método clássico de cultura BMDC - Método Inaba | Preparação em larga escala do método BMDC - Son | Preparação em larga escala de BMDC - método Lutz |
| Número de citações no PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Hemólise da medula óssea, lise dos glóbulos vermelhos | SIM | SIM | Não |
| A medula óssea primeiro remove os linfócitos | SIM | Não | Não |
| Remoção de granulócitos durante a cultura | SIM | Não | Não |
| Volume inicial de plaqueamento de células da medula óssea | 1ml | 15ml | 10ml |
| Incubadora | Placas de cultura de células de 24 poços | Placa de cultura celular de 6 poços | Placa de cultura bacteriana de 100 mm |
| Meio de cultura | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Concentração de GM-CSF de camundongo | 200-1000 U/mL | A concentração inicial adicionada é de 125-1000 U/mL No 4º e 7º dias, quantidades suficientes de GM-CSF e IL-4 são adicionadas ao sistema de cultura. | A concentração inicial adicionada é de 200 U/mL.3-100 U/mL depois do 10º dia |
| IL-4 de camundongo | Não precisa | Precisar，A concentração é a mesma do GM-CSF | Não precisa |
| Método de troca de fluidos | No 2º e 4º dia, descarte 50%-75% do meio de cultura antigo (que contém células) e substitua por meio de cultura completo e fresco contendo GM-CSF suficiente. | / | No 3º dia, um volume igual de meio de cultura completo contendo GM-CSF foi adicionado. No 6º, 8º e 10º dias, metade do meio foi substituída. O meio de cultura antigo (contendo células) foi aspirado, centrifugado, ressuspenso em meio de cultura completo fresco contendo GM-CSF e então recolocado. |
| Tempo de cultura antes da passagem (expansão) | 6 dias | 7 dias | 10 dias |
| Tempo de cultura após a passagem (maturação) | 2 dias | Nenhum | 1-2 dias |
| Indutor de maturidade total | TNF-α（250 U/mL） | LPS (1-10 (μg/mL) | TNF-α（250 U/mL）ou LPS(1 (μg/mL) |
| Tempo de colheita de células DC | 7-8 dias | 7-8 dias | 10-13 dias |
| Pureza DC | Dia 8：60-70% | Dia 7：85-95% | Dia 10-12：80-90% |
| Produção DC/mouse | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Reagentes de cultura DC recomendados
| Nome do produto | Gato | Tamanho |
| 91108ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 micrograma | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 micrograma | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 micrograma | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 micrograma |