1.Prefácio
Macrófagos são grandes fagócitos diferenciados de monócitos no sangue. Eles estão presentes em quase todos os tecidos, especialmente aqueles que estão em contato frequente com o mundo externo, como pele, pulmões e intestinos. Os macrófagos desempenham um papel vital em muitos processos biológicos, como defesa imunológica humana, resposta inflamatória, reparo de tecidos, regulação imunológica e desenvolvimento de doenças.
Macrófagos humanos primários são difíceis de isolar de tecidos em números suficientes e não proliferam em cultura. Macrófagos derivados de monócitos fornecem uma excelente alternativa porque monócitos no sangue humano são facilmente obtidos em grandes quantidades e podem ser diferenciados em macrófagos in vitro.
2. Funções biológicas dos macrófagos
- Fagocitose
Os macrófagos reconhecem e engolfam patógenos e restos de células mortas por meio de receptores em sua superfície. Esse processo não só ajuda a limpar a infecção, mas também previne que essas substâncias se acumulem no corpo, o que poderia causar inflamação ou outros problemas.
- Defesa anti-patógeno
Os macrófagos combatem patógenos produzindo substâncias químicas que matam microrganismos, como oxigênio reativo e óxidos de nitrogênio, bem como citocinas e quimiocinas que regulam respostas inflamatórias.
- Regulação da inflamação
Os macrófagos desempenham um papel complexo nas respostas inflamatórias. Eles podem não apenas promover a inflamação liberando citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 1 (IL-1), mas também inibir a inflamação produzindo citocinas anti-inflamatórias, como IL-10 e TGF-β.
- Reparação e reconstrução de tecidos
Após uma resposta inflamatória, os macrófagos ajudam a reparar e regenerar tecidos secretando vários fatores de crescimento. Eles limpam os restos de danos enquanto promovem a formação de novos tecidos.
- Imunomodulação
Os macrófagos promovem respostas imunes específicas ao apresentar antígenos às células T. Ao mesmo tempo, eles regulam outros componentes do sistema imunológico ao secretar várias citocinas, como a regulação da atividade das células T e células B.
- Relação com doenças
Os macrófagos desempenham um papel importante no desenvolvimento de muitas doenças, incluindo doenças infecciosas, doenças autoimunes, tumores e doenças inflamatórias crônicas, como a aterosclerose.
3. Classificação dos macrófagos
De acordo com seu estado de ativação e função, os macrófagos podem ser divididos em duas categorias principais: M1 e M2. Esses dois subtipos desempenham papéis diferentes na resposta imune e na regulação da inflamação.
Macrófagos M1
Os macrófagos M1 são estimulados principalmente por citocinas como o interferon gama (IFN-γ) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e têm características pró-inflamatórias. Eles têm forte atividade antimicrobiana, podem produzir radicais livres de oxigênio e fatores inflamatórios, e participam da matança e limpeza de microrganismos patogênicos, como bactérias e vírus.
Os macrófagos M1 participam da defesa imunológica e da resposta inflamatória do corpo, promovem a infiltração de células inflamatórias e imunológicas, auxiliam na limpeza de tecidos infectados e danificados e promovem a ocorrência e manutenção de respostas imunológicas inflamatórias.
Macrófagos M2
Os macrófagos M2 são estimulados principalmente por citocinas como a interleucina-4 (IL-4) e a interleucina-13 (IL-13), e têm características anti-inflamatórias e de reparação. Eles participam de processos de reparação e regeneração de tecidos, promovem respostas anti-inflamatórias e regulação imunológica.
Os macrófagos M2 desempenham um papel importante no estágio final da inflamação e do reparo tecidual, promovem a resolução da inflamação e do reparo tecidual, regulam o equilíbrio das respostas imunológicas e promovem a regeneração e o reparo tecidual.
Figura 1. Resumo dos principais estados de polarização dos macrófagos ativados [1]
4. Isolamento, cultura e diferenciação de macrófagos in vitro
4.1 Método de separação
- Isolamento do sangue periférico
Isolamento de monócitos: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas usando centrifugação de gradiente de densidade (por exemplo, Ficoll-Paque). A amostra de sangue é adicionada à camada superior de Ficoll e, após a centrifugação, os monócitos são localizados entre as camadas de plasma e Ficoll.
Isolamento de macrófagos: Após os monócitos serem isolados de PBMCs, as células precursoras mononucleares podem ser isoladas ainda mais por adesão plástica. Os monócitos são cultivados em placas de cultura plásticas por várias horas, as células não aderentes são removidas e as células aderentes restantes são principalmente células precursoras mononucleares.
- Isolamento de tecidos
Amostras de tecido são quebradas em suspensões de células únicas por tratamento mecânico e/ou enzimático (por exemplo, colagenase e DNase). Células não-alvo são removidas por centrifugação de gradiente de densidade ou seleção negativa (usando anticorpos e esferas magnéticas) e macrófagos são coletados.
4.2 Método de cultura
Os meios de cultura comumente usados incluem RPMI 1640 ou IMDM, que geralmente precisam ser suplementados com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e fatores de crescimento necessários. As condições de cultura geralmente são em uma incubadora a 37°C e 5% de CO2
4.3 Método de indução de diferenciação
- Diferenciação de células precursoras mononucleares
Usando M-CSF: Adicione fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) ao meio de cultura, geralmente em uma concentração de 20-50 ng/mL, e continue cultivando por 7-10 dias para induzir a diferenciação de células precursoras mononucleares em macrófagos.
Usando GM-CSF: O fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) também pode induzir a diferenciação de macrófagos, especialmente a tendência de produzir macrófagos M1 (pró-inflamatórios).
- Maior regulação do fenótipo e da função
Macrófagos M1: pode ser induzido pela adição de IFN-γ (interferon-γ) e LPS (lipopolissacarídeo) ao meio de cultura.
Macrófagos M2: pode ser induzida pela adição de citocinas anti-inflamatórias, como IL-4 e IL-13.
Esses métodos permitem que pesquisadores estudem as várias funções biológicas dos macrófagos e seu comportamento sob condições patológicas in vitro. As condições operacionais específicas de cada etapa (como densidade celular, tempo de cultura, concentração de fatores adicionados, etc.) podem precisar ser otimizadas de acordo com o propósito específico do experimento.
Tabela 1.Cultura de macrófagos e condições de indução
| Fonte de célula | Meio de cultura | Adições iniciais | Polarização M1 | Polarização M2 |
| Célula THP-1 | RPMI 1640 | 100 ng/mL de PMA | 20 ng/mL de IFN-γ 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL de IL-4 20 ng/mL de IL-13 |
| Monócitos | RPMI 1640 | M1:50 ng/mL GM-CSF M2: 50 ng/mL M-CSF | 10 ng/mL LPS 50 ng/mL de IFN-γ | M2a: 20 ng/mL IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/mL de TGF-β1 ou 10 ng/mL de IL-10 |
| Mseta | IMDM | 10-50 ng/mL de LCR-M | 100 ng/mL LPS (50ng/mL de IFN-γ pode ser adicionado) | 10 ng/mL de IL-4 (10 ng/mL de IL-13 podem ser adicionados) |
| RAW264.7 Célula | DMEM | / | 100 ng/mL LPS | 20 ng/mL IL-4 (20 ng/mL IL-10 pode ser adicionado） |
5. Dados do ensaio
A YEASEN fornece uma série de produtos de citocinas de alta atividade HiActive® relacionados à cultura de macrófagos para dar suporte à pesquisa de macrófagos.
Citocinas altamente ativas HiActive®：A atividade biológica de cada citocina foi verificada para garantir a alta atividade da citocina.
Dados de verificação de atividade:
Proteína M-CSF de camundongo recombinante
Figura 1. Medido em um ensaio de proliferação celular usando camundongo M‑NFS‑60 células linfoblásticas de leucemia mielogênica. O ED50 para esse efeito é tipicamente 16,74 -25,83 ng/ml.
Recombinante Camundongo GM-CSF Proteína
Figura 2. O ED50 conforme determinado por um ensaio de proliferação celular usando células FDC-P1 murinas é de 2,79-12,84 pg/mL.
Recombinante IL-10 humana Proteína
Figura 3. O ED50 determinado por um ensaio de proliferação celular usando células murinas MC/9 é menor que 0,1 ng/mL, correspondendo a uma atividade específica de > 1,0×107 UI/mg.
Produtos relacionados
| Classificação | Espécies | Gato | Especificação |
| G-CSF | Humano | 2 μg/10 μg/ 50 μg/ 100 μg | |
| Rato | 2 μg/ 10 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
|
M-CSF | Humano | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Rato | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
GM-CSF | Humano | 5 μg/50 μg/100 μg/ 500 μg | |
| Rato | 10 mcg/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-γ | Humano | 20 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Rato | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-4 | Humano | 5 μg/50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Rato | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Humano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Rato | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Humano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Rato | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Referências
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Papel da Polarização de Macrófagos Humanos na Inflamação durante Doenças Infecciosas. Int J Mol Sci. 2018 Jun 19;19(6):1801.