1.Antecedentes da Laminina 521
Laminina 521 (LN521) é uma proteína de adesão celular essencial no nicho natural de células-tronco e uma matriz para a cultura e expansão de células-tronco embrionárias humanas (hES) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC). LN521 se liga a receptores de superfície celular e ativa vias de sinalização celular, resultando na produção de células mais funcionais.
A laminina 521 reproduz o ambiente hPSC biologicamente relevante in vitro, promove a fixação, alta sobrevivência e forte autorrenovação de longo prazo da hPSC, e é uma proteína de matriz essencial que suporta o crescimento de células-tronco e mantém a estabilidade da estrutura e desempenho da membrana basal. A laminina 521 também é uma das matrizes de cultura sem nutrientes mais comumente usadas. Além disso, a laminina 521 pode atingir a passagem eficiente de células-tronco geneticamente estáveis e pluripotentes sem a adição de quaisquer inibidores de apoptose. As células crescem em uma monocamada uniforme sem a necessidade de remover manualmente quaisquer áreas de diferenciação. Além disso, estudos mostraram que a LN521 pode suportar o crescimento da PSC por mais de 10 gerações sem quaisquer sinais de anormalidades do cariótipo, e mantém a capacidade da PSC de se diferenciar nas três camadas germinativas das camadas germinativas interna, média e externa.
Figura 1. Estrutura da laminina 521 [1]
2. Experimento de revestimento de laminina
2.1 Prepare laminina 521 a 400 µg/ml com água deionizada estéril ou água para injeção. Recomenda-se diluir ainda mais para 100 µg/ml com 1×DPBS estéril (Ca++/Mg++) antes do uso e, em seguida, diluir para uma concentração de trabalho de 5-10 µg/ml com DPBS estéril (Ca++/Mg++). A concentração de revestimento varia dependendo do tipo de células cultivadas e recomenda-se otimizar o protocolo experimental para determinar a concentração de revestimento ideal para as células. Consulte a Tabela 1 para obter as concentrações recomendadas.
Observação: DPBS contendo Ca2+ e Mg2+ deve ser usado, pois cátions divalentes são importantes para a estrutura e função da proteína. A concentração de trabalho necessária de Laminin 521 depende das células e da aplicação. Recomendamos uma concentração inicial de revestimento de 0,5 μg/cm2.
Tabela 1. Volumes recomendados de solução de trabalho de laminina humana recombinante para diferentes recipientes de cultura.
| Placa de Petri | Concentração de revestimento (μg/mL) | Quantidade adicional de LN521 | Valor adicional de 1*DPBS | Volume total |
| 6 poço | 5 | 50 μL/poço | 950 μL/poço | 1 mL/poço |
| 12 poços | 5 | 25 μL/poço | 475 μL/poço | 0,5 mL/poço |
| 24 poços | 5 | 15 μL/poço | 285 μL/poço | 0,3 mL/poço |
| 48 bem | 5 | 7,5 μL/poço | 142,5 μL/poço | 150 μL/poço |
| 96 bem | 5 | 3,5 μL/poço | 66.5 μL/poço | 70 μL/poço |
| Placa de Petri de 35 mm | 5 | 50 μL/poço | 950 μL/poço | 1 mL/poço |
| Placa de Petri de 60 mm | 5 | 100 μL/poço | 1900 μL/poço | 2 mL/poço |
| Placa de Petri de 100 mm | 5 | 300 μL/poço | 5700 μL/poço | 6 mL/poço |
O volume acima é baseado em uma concentração de revestimento de 5μg/mL.
2.2 Adicione o volume especificado da mistura de laminina-DPBS a cada poço e agite suavemente. Certifique-se de que toda a superfície esteja coberta com solução de revestimento de laminina, pois superfícies não revestidas não suportam o crescimento celular.
2.3. Coloque a placa em uma incubadora a 37°C e incube durante a noite. O tempo mínimo de incubação é de 2 horas, mas a incubação durante a noite é recomendada para obter condições ideais de cultura celular. Tenha cuidado para não deixar o recipiente de cultura secar, o que inativará o LN521.
2.4. Quando as células estiverem prontas para serem semeadas, aspire a solução de laminina 521.
3. Cultura iPSC
3.1 Descongelamento de iPSC (tomando como exemplo uma placa de 12 poços)
3.1.1 Remova as iPSCs do nitrogênio líquido ou gelo seco e descongele em água a 37°C por 10 segundos.
3.1.2 Esterilize os criotubos com álcool 75% e transfira-os para uma superfície de trabalho.
3.1.3 Transfira as células para um novo tubo de centrífuga de 15 mL contendo 9 mL de DMEM‑F12.
3.1.4 Centrifugue o tubo de centrífuga de 15 mL a 300 g por 5 minutos em temperatura ambiente.
3.1.5 Descarte a solução de laminina da placa revestida de 12 poços.
3.1.6 Descarte o sobrenadante celular e ressuspenda delicadamente as iPSCs em 1 mL de mTeSR-plus (contendo 10 µM de Y-27632) e transfira-as para a placa revestida de 12 poços. Agite a placa para distribuir uniformemente as células até uma densidade celular final de 1×10^5 células/poço e deixe em temperatura ambiente por 10 minutos. Certifique-se de que a cultura seja passada dentro de 4-5 dias.
3.1.7 Retorne a placa de 12 poços para a incubadora a 37°C para incubação.
3.1.8 O meio de cultura contendo o inibidor ROCK deve ser removido após 12-16 horas e continuar a ser cultivado no meio sem inibidor.
Tabela 2. Densidade de semeadura celular em diferentes recipientes de cultura, número de células determinado de acordo com a taxa de crescimento celular
| Vasos de cultura celular | 6 poço | 12 poços | 24 poços | 96 bem |
| Número de celular | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. Protocolo de passagem iPSC
3.2.1 Descarte o sobrenadante da cultura e enxágue com 1 mL de PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Observação: Use PBS sem Ca2+ e Mg2+, pois cátions divalentes têm um efeito negativo em algumas enzimas de dissociação.
3.2.2 Descarte o PBS e adicione 0,5 mL de reagente de dissociação celular suave.Incube em temperatura ambiente por 6 a 8 minutos ou observe no microscópio até que as células não estejam mais ligadas à placa.
3.2.3 Adicione um volume igual de DMEM-F12, misture suavemente as células, transfira para um tubo de centrífuga em temperatura ambiente e centrifugue a 300 g por 5 minutos.
3.2.4 Antes de passar as células, prepare uma placa de 12 poços revestida com laminina.
3.2.5 Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em meio mTeSR‑plus contendo 10 µM Y‑27632.
3.2.6 Transfira as células para a placa de 12 poços revestida com laminina preparada. Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente as células e deixe em temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.
3.2.7 Coloque a placa de 12 poços em uma incubadora a 37°C e incube.
Observação: As iPSCs se diferenciarão rapidamente e morrerão após crescerem em uma monocamada. Para manter o crescimento e a pluripotência, elas precisam ser passadas antes de serem confluentes.
3.3. Criopreservação de iPSC
3.3.1 Prepare o reagente suave para dissociação celular.
3.3.2 Realize a separação das células de acordo com o protocolo de passagem de iPSC, use a contagem de organelas celulares para garantir a densidade celular antes da criopreservação.
3.3.3 Cada tubo de células deve ser congelado em uma densidade celular de 1-2×10^6. Siga as etapas de centrifugação e remoção do meio de cultura celular no protocolo de passagem de iPSC. Ressuspenda o pellet de iPSC isolado em um volume apropriado de solução de criopreservação
3.3.4 Adicione 1 mL do pellet de criopreservação de células ressuspensas a um tubo de criopreservação de 1,5 mL, execute o resfriamento do programa e, em seguida, transfira para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
4.Notas importantes sobre o revestimento de laminina
4.1. Todas as etapas do protocolo experimental devem ser realizadas em condições estéreis.
4.2. Evite expor a laminina à temperatura ambiente por muito tempo.
4.3. Evite congelamento e descongelamento repetidos
4.4. Após o descongelamento, a solução de estoque de proteína não diluída pode ser armazenada a 2~8℃ sob condições estéreis e pode ser armazenada de forma estável por pelo menos 3 meses.
5.Informações relacionadas ao produto
| Nome do produto | Gato# | Tamanho |
| Proteína Laminina 521 Humana Recombinante (Sem Origem Animal) | 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Referências
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Análise cristalográfica do braço curto da laminina β2 revela como o domínio LF é inserido em uma matriz regular de domínios LE. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.