Puromicina é um antibiótico aminoglicosídeo produzido por Streptomyces alboniger. É um análogo da extremidade 3' da molécula de aminoacil-tRNA e pode se ligar ao sítio A do ribossomo, incorporando-se à cadeia peptídica em extensão, interrompendo a translocação peptídica no ribossomo, causando a terminação prematura da cadeia durante a tradução e, portanto, inibindo a síntese de proteínas.
Figura 1 Fórmula estrutural de Puromicina (CAS NO. 53-79-2)
O gene pac, que codifica a puromicina N-acetiltransferase (pac), foi encontrado na bactéria produtora de puromicina Streptomyces alboniger, conferindo resistência à puromicina. Essa característica é agora amplamente usada para rastrear linhas celulares transfectadas estáveis de mamíferos carregando plasmídeos com o gene pac. O uso generalizado de puromicina na triagem de linhas celulares estáveis está relacionado às características dos vetores lentivirais, a maioria dos quais carrega o gene pac em vetores lentivirais comerciais. Em certos casos específicos, a puromicina também pode ser usada para rastrear cepas de E. coli transformadas com plasmídeos carregando o gene pac. A puromicina age rapidamente e pode causar morte celular rapidamente em baixas concentrações. Células de mamíferos aderentes são sensíveis a concentrações de 2-5 µg/mL de puromicina, enquanto células em suspensão já são sensíveis a concentrações tão baixas quanto 0,5-2 µg/mL de puromicina. Células de mamíferos com resistência estável à puromicina podem ser geradas em uma semana.
Triagem de linha celular estável
Princípio Experimental
Ao clonar DNA/shRNA exógeno em um vetor que carrega o gene pac, o vetor recombinante é transfetado em células hospedeiras e integrado em seus cromossomos, transmitido de forma estável com a divisão celular e, finalmente, rastreado com puromicina.
Preparação e pré-experimento
1 Concentrações de uso recomendadas
Células de mamíferos: 1-10 μg/mL, a concentração ideal precisa ser determinada por pré-experimento.
E. coli: Para triagem de E. coli transformada estável carregando o gene pac em meio LB agar, use uma concentração de 125 μg/mL. O ajuste preciso do pH é necessário para triagem de puromicina de transformantes estáveis de E. coli.
2 Método de dissolução
Dissolva puromicina em água destilada para preparar uma solução estoque de 50 mg/mL, esterilize por filtração com um filtro de 0,22 μm, aliquote e armazene a -20°C.
3 Determinação da curva de morte de puromicina (usando transfecção de shRNA ou transdução lentiviral como exemplo)
A concentração de triagem efetiva de puromicina está relacionada ao tipo de célula, status de crescimento, densidade celular, metabolismo celular e posição do ciclo celular. É crucial determinar a concentração mínima de puromicina que mata células não transfectadas. É essencial realizar um pré-experimento de triagem de gradiente de puromicina para o primeiro experimento para estabelecer uma curva de morte.
- Células de placa com densidade de 5~8×104células/poço em uma placa de 24 poços e cultura durante a noite.
- Preparar meio de triagem: Meio fresco contendo diferentes concentrações de puromicina (por exemplo, 0-15 μg/mL, pelo menos 5 gradientes).
- Substitua por meio de triagem recém-preparado, continue a cultura e observe o crescimento celular, trocando o meio de triagem fresco a cada 2-3 dias.
- Observe a sobrevivência das células diariamente; a concentração do medicamento que efetivamente mata todas as células não transfectadas dentro de 4 a 6 dias é a concentração mínima.
Triagem de transfectantes estáveis
- Após infecção lentiviral por 48-72h (70-80% de confluência), cultive as células em meio contendo uma concentração apropriada de Puromicina por pelo menos 48h. Quando todas as células no grupo de controle não transfetado com puromicina morrem, as células restantes no grupo infectado pelo vírus são todas células positivas.
【Observação】: ① O efeito dos antibióticos é mais pronunciado quando as células estão em uma fase de divisão ativa. A eficácia dos antibióticos será significativamente reduzida se as células forem muito densas. A densidade celular não deve exceder 25%. ② Observe o status de crescimento celular diariamente; a triagem de puromicina requer pelo menos 48 h, e a concentração efetiva da triagem de puromicina geralmente dura de 3 a 10 dias. Quanto maior o MOI do vírus, mais cópias de shRNA e gene de resistência à puromicina cada célula contém. Ao realizar a triagem de puromicina, quanto maior o MOI, mais cópias de pac as células contêm e maior a concentração de puromicina que elas podem tolerar. Ajuste a concentração de puromicina para rastrear células transfetadas, mas a concentração de puromicina não deve ser menor do que a concentração efetiva mínima da curva de eliminação;
- Adicione meio de cultura contendo a concentração mínima de Puromicina para expandir as células e, após os resultados do teste de qPCR serem qualificados, prossiga com a criopreservação.
| Produtoe nome | Gato# | Especificação | Aparência |
| Puromicina Dicloridrato CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Branco a um pó branco |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 g | ||
| Puromicina (Solução 10 mg/mL) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 mL | Solução（10 mg/mL em H2O） |
| 60209ES50 | 5×1 mL | ||
| 60209ES60 | 10×1 mL | ||
| 60209ES76 | 50×1 mL |
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