Quando se trata de telômeros e protelomerase em biologia, as mentes das pessoas geralmente pensam primeiro no envelhecimento, um fenômeno natural inevitável. Telômeros é sequências repetitivas de DNA nas extremidades dos cromossomos eucarióticos, que carregam a responsabilidade de manter a integridade dos cromossomos e regular o ciclo de divisão celular.
Protelomerase é uma enzima de síntese de DNA transcriptase reversa que estende os telômeros. É uma nucleoproteína composta de RNA e proteínas. O componente proteico pode catalisar a síntese de sequências repetidas de telômeros com o componente RNA.
Figura 1. Mecanismo de extensão do telômero mediada pela protelomerase[1]
Protelomerase pode reparar e alongar telômeros, compensar defeitos na replicação do DNA, prevenir a perda de telômeros durante a divisão celular e aumentar o número de divisões celulares. Em 2009, o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina foi concedido a Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider e Jack W Szostak por suas contribuições excepcionais em Revelando o papel crucial dos telômeros e da Protelomerase na função celular e no envelhecimento.
Hoje, quero apresentar a vocês uma Protelomerase única: TelN proProtelomerase. TelN Protelomerase vem do bacteriófago N15 e é um componente do sistema de replicação N15, participando na geração de DNA de profago linear. Ao contrário da Protelomerase em eucariotos, TelN é uma enzima proteica pura sem nenhum componente de RNA. Possui clivagem-ligação atividade e deixa uma extremidade covalentemente fechada no local de clivagem após cortar o DNA fita dupla (dsDNA).
Figura 2. Protelomerase TelN Local de clivagem
Protelomerase TelN Mecanismo de Ação
O sítio de reconhecimento da TelN Protelomerase é uma sequência palíndromo com 56 pb de comprimento, com telR e telL em ambos os lados. A posição central da sequência alvo também é uma sequência palíndromo telO. TelN Protelomerase cliva dentro da sequência telO e forma uma estrutura de grampo covalentemente fechada nas duas extremidades de clivagem. A extremidade do DNA após a digestão ainda é composta de telR e telL, que é conhecido como osso de cachorro ADN (dbDNA).
Figura 3. Protelomerase mecanismo de clivagem no sítio TelN[2]
Devido à atividade especial de clivagem-ligação enzimática da TelN Protelomerase, o DNA plasmídeo circular pode ser convertido em moléculas lineares covalentemente fechadas em forma de haltere por meio de uma reação enzimática de uma etapa. Comparado com moléculas de DNA linear aberto, o DNA linear fechado tem maior nível de expressão de proteína nas células, o que é muito adequado para a construção de mini DNA linear fechado com alta estabilidade e sequência estranha mínima. O DNA plasmídeo desempenha um papel vital como o elemento central da vacina de mRNA, vacina de DNA e terapia genética celular. O método tradicional de produção de plasmídeo envolve fermentação com E. coli e amplificação multiestágio, e o risco incontrolável no processo de fermentação limita o rendimento de plasmídeo de alta qualidade, o que se torna a chave para limitar a capacidade de produção de vacinas. A empresa Touchlight no Reino Unido lançou uma tecnologia dbDNA inovadora. Esta tecnologia interrompe o método tradicional de fermentação bacteriana para preparação de DNA plasmídeo e em vez de usar síntese enzimática in vitro de DNA. A atividade especial de clivagem-ligação enzimática da TelN Protelomerase também é empregada para gerar mini DNA linear de extremidade fechada no método acima.
Aplicação da TelN Protelomerase na Síntese Enzimática de DNA
O método enzimático de DNA in vitro baseado em phi29 DNA polymerase e TelN Protelomerase pode evitar muitos riscos incontroláveis no processo de fermentação biológica, e o método enzimático in vitro pode sintetizar DNA com alta velocidade e alto rendimento. O DNA sintetizado pode ser usado em muitas tecnologias emergentes, como vacina de mRNA, vacina de DNA, vetor de terapia genética e edição genética.
Figura 4. Fluxograma da síntese enzimática de DNA[3]
Processo de síntese enzimática de DNA
- Desnaturação de modelo
O molde de DNA plasmídeo circular é convertido em dois DNAs circulares de fita simples por um processo de desnaturação.
- Amplificação do círculo rolante
A amplificação do círculo rolante foi realizada usando a DNA polimerase Phi29 e DNA circular de fita simples para gerar DNA concatemérico de fita dupla linear longo com intervalos de sequência de reconhecimento da Protelomerase.
- Corte e Fechamento Covalente
A TelN Protelomerase reconhece o telRL no DNA de complexos teloméricos e realiza atividades de clivagem-ligação para gerar monômeros de DNA lineares e covalentemente conectados.
- Remoção do DNA da estrutura bacteriana
Endonucleases de restrição ou exonucleases degradam o DNA do esqueleto bacteriano com uma estrutura aberta na extremidade para obter DNA contendo apenas os elementos de expressão do gene alvo. A síntese enzimática da tecnologia de DNA ignora a fermentação biológica e pode atingir rapidamente a síntese de DNA plasmídeo de nível GMP, resolvendo as limitações de capacidade de produção nos campos de terapia genética e vacinas de mRNA. Ela tem um enorme potencial para industrialização. Para promover o desenvolvimento da tecnologia de síntese enzimática de DNA, a YEASEN Biology pode fornecer materiais enzimáticos essenciais para a síntese enzimática de DNA, como a DNA polimerase phi29 (14404ES) e a TelN Protelomerase (14540ES), para auxiliar na pesquisa e produção da tecnologia de síntese enzimática de DNA.
Papresentação de desempenho de YEASEN Protelomerase TelN
- O desempenho da clivagem e ligadura é excelente, o que é equivalente ao das marcas importadas.
Usando um plasmídeo superenrolado contendo o sítio de reconhecimento da TelN Protelomerase como molde, a enzima de adição de gradiente (0,078-5 U) da YEASEN e da marca A foi adicionada. 0,5 μg do plasmídeo superenrolado foi convertido em DNA de fita dupla linear fechado (dsDNA). A eletroforese em gel foi usada para detectar a eficiência da conversão, e os resultados mostraram que a atividade de clivagem e ligação da TelN Protelomerase da YEASEN era equivalente à da Marca A.
Figura 5. Detecção da atividade de clivagem da protelomerase do TelN M:Marker, C: controle do plasmídeo superenrolado
- A integridade do fechamento do dsDNA linear > 90%
Usando o plasmídeo superenrolado contendo o sítio de reconhecimento da TelN Protelomerase como molde, adicionando TelN Protelomerase de YEASEN e marca A, convertendo 0,5 μg de plasmídeo superenrolado em dsDNA linear fechado e adicionando exonuclease T5 para detectar sua integridade final através do grau de degradação de banda. Os resultados mostraram que a integridade do fechamento final do dsDNA gerada pela TleN Protelomerase de YEASEN foi > 90%, o que foi equivalente à da marca A.
Figura 6. Teste de integridade de fechamento final da TelN Protelomerase. C1: plasmídeo contendo sítio de reconhecimento TelN, sem TelN Protelomerase; C2: plasmídeo contendo sítio de reconhecimento TelN, TelN Protelomerase, sem exonuclease T5; Plasmídeo: plasmídeo contendo sítio de reconhecimento TelN.
Produtos relacionados de Síntese Enzimática de DNA
| Classificação do produto | Nome do produto | Nº de catálogo. |
| Protelomerase | 14540ES | |
| Polimerase de DNA Phi29 | 14404ES | |
| Exonuclease | Exonuclease III | 14525ES |
| 14538ES | ||
| dNTP | 10125ES |
Rreferências
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. Telômero e Protelomerase biologia. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. O mini DNA linear fechado gerado pela enzima de clivagem-união procariótica TelN é funcional em células de mamíferos. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. O mini DNA linear fechado gerado pela enzima de clivagem-união procariótica TelN é funcional em células de mamíferos. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.