Com o rápido desenvolvimento da glicoproteômica e da pesquisa de medicamentos de anticorpos, a modificação da glicosilação também atraiu muita atenção. O contato entre células e células, e entre células e patógenos é concluído principalmente por meio da interação de açúcares e proteínas, e a glicosilação determina as propriedades de adesão dos glicoconjugados. Na IgG, a glicosilação conservada ligada a N em Asn297 na região Fc também é crucial para sua atividade. Além disso, alguns anticorpos também têm N-glicanos adicionais, que, juntamente com o sítio conservado em Asn297 na região Fc, afetam o reconhecimento, a meia-vida e a resposta imune do anticorpo.
A glicosilação de proteínas é uma modificação pós-traducional complexa que envolve a conexão de cadeias de glicano em locais específicos nas proteínas. Dependendo do tipo de cadeia de glicano, as glicoproteínas são divididas em glicoproteínas ligadas a N, glicoproteínas ligadas a O, etc.; além disso, a glicosilação de proteínas também é afetada pelo tipo de célula hospedeira e condições de fermentação (como meio de cultura, valor de pH, temperatura, etc.). Portanto, as glicoproteínas geralmente têm heterogeneidade nos padrões de glicosilação, incluindo locais de glicosilação, níveis de glicosilação e a estrutura específica das cadeias de glicano, tornando a análise da cadeia de glicano e o trabalho de caracterização estrutural extremamente desafiadores. Para obter a quantidade máxima de informações estruturais da cadeia de glicano, a principal estratégia da análise da cadeia de glicano é primeiro liberar as cadeias de glicano das proteínas e, em seguida, realizar análise e caracterização detalhadas. Nessa estratégia, um método de desglicosilação eficiente, preciso e estável é crucial.
Métodos enzimáticos são atualmente amplamente utilizados para desglicosilação.
As glicoproteínas podem ser classificadas em glicopeptídeos ligados a N e ligados a O com base em seus tipos de cadeias de glicano. Para glicopeptídeos ligados a N, as enzimas comumente usadas incluem peptídeo N-glicosidase F (PNGase F), endoglicosidase H (Endo H) e endoglicosidase S (Endo S). A PNGase F hidrolisa a ligação GlcNAc-Asn e pode remover cadeias de glicanos de alta manose, complexas e híbridas. Endo H cliva ligações glicosídicas dentro do núcleo pentassacarídeo da cadeia N-glicano. Endo S cliva especificamente glicanos ligados a N do núcleo de quitobiose da cadeia pesada de IgG nativa.
Figura 1. Sítio de corte de PNGase F, Endo H e Endo S.
Entre eles, PNGase F é o método enzimático mais eficaz para remover quase todos os N-ligados oligossacarídeos em glicoproteínas, que podem clivar glicoproteínas oligossacarídicas complexas, híbridas e de alta manose conectadas por asparagina, removendo especificamente glicanos ligados a N. O sítio de clivagem é: a ligação amida entre a N-acetilglucosamina mais interna (GlcNAc) e o resíduo de asparagina, enquanto converte a asparagina na proteína após hidrólise enzimática em ácido aspártico.
Quando a α1-6 fucose está localizada no núcleo GlcNAc, a PNGase F também pode cortar; somente quando a α1-3 fucose está localizada no núcleo GlcNAc (comum em glicoproteínas de plantas e insetos), a PNGase F não pode cortar.
No entanto, a reação enzimática convencional da PNGase F requer várias horas para liberar N-glicanos de anticorpos e, devido à preferência pela liberação de glicanos, a desglicosilação incompleta pode levar a resultados tendenciosos, e a distribuição de glicanos obtida pode não representar a composição correta de anticorpos terapêuticos. Portanto, obter um perfil preciso de N-glicanos o mais rápido possível é crucial para o monitoramento da glicosilação durante o processo de produção de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpos e outros agentes bioterapêuticos.
PNGase F rápido
Fast PNGase F é um reagente recombinante otimizado que pode desglicosilar rápida e completamente anticorpos, imunoglobulinas, proteínas de fusão e outras glicoproteínas em poucos minutos. Esta enzima pode remover rapidamente e sem preferência todos os N-glicanos e pode ser usada diretamente para análise de cromatografia downstream ou espectrometria de massa.
Características do produto:
Rápido: Desglicosilação completa e rápida em poucos minutos.
Alta Pureza: Sem contaminação por protease ou glicosidase, pureza ≥95%.
Não seletivo: Remova rapidamente e sem preferência todos os N-glicanos.
Boa compatibilidade: Usado diretamente para análise de cromatografia downstream ou espectrometria de massa.
Dados de teste:
Desglicosilação de proteínas em uma etapa:
- 10 ug de substrato/100 ug de anticorpo e ddH2O misturados até um volume total de 16 uL;
- Adicionar 4 μL de Fast PNGase F Buffer (5x), volume final 20 uL;
- Adicione 1 μL de Fast PNGase F.
- Incube a 50°C por 10 minutos.
Figura 2. Efeito de clivagem enzimática em uma etapa no substrato proteico (A) e no anticorpo (B).
1: Marcador de proteínaCat#20350ES) 2: Concorrente + substrato ou anticorpo 3: Concorrente + substrato ou anticorpo 4:
Desglicosilação de proteínas em duas etapas:
- 10 ug de substrato/100 ug de anticorpo e ddH2O misturados até um volume total de 16 uL;
- Adicionar 4 μL de Fast PNGase F Buffer (5x), volume final 20 uL;
- Incube a 80°C por 2 minutos e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Adicione 1 μL de Fast PNGase F.
- Incube a 50°C por 10 minutos.
Figura 3. Efeito de clivagem enzimática em duas etapas no substrato proteico (A) e no anticorpo (B).
1: Marcador de proteínaCat#20350ES) 2: Concorrente + substrato ou anticorpo 3: Concorrente + substrato ou anticorpo 4:
Conclusão:
- A
Yeasen Fast PNGase F tem a mesma ou maior eficiência de clivagem enzimática que os concorrentes importados nas mesmas condições de reação; - É recomendado realizar uma clivagem enzimática de duas etapas para garantir maior eficiência de clivagem enzimática. Alguns anticorpos (como Fab N-glicosilação) requerem uma etapa de pré-aquecimento
para desglicosilação eficiente.
Além disso,
Guia de Compra
| Número do produto | 20406ES | 20407ES | 20414ES | 20413ES |
| Nome do produto | Rápido PNGase F | PNGase F | Endo H | Endo S |
| Fonte | Expressão recombinante de levedura | Expressão recombinante de levedura | Expressão recombinante de levedura | E. coli expressão recombinante |
| Atividade Específica | Não aplicável | 100000U/mL | 1000000U/mL | 8000 U/mg |
| Local de clivagem | Quase todos os glicanos ligados a N | Quase todos os glicanos ligados a N | Glicanos de alta manose ligados a N | Cliva-se dentro da estrutura central do dissacarídeo da cadeia pesada da IgG |
| Tempo de digestão | 10 minutos | 1-3 horas | 1-3 horas | 1 hora |
| Glicosilação | Adequado | Adequado | Adequado | Adequado |
| Estrutura da proteína | Adequado | Adequado | Adequado | Adequado |
Informações de pedidos
| Nome do produto | Número do produto | Especificação |
| 20406ES20/50 | 20 toneladas/50 toneladas | |
| 20407ES01/02 | 15000 U /75000 U | |
| 20414ES92/97 | 10000 U /50000 U | |
| 20413ES80/90 | 1000 U/5 x 1000 U |