À medida que a pesquisa médica continua a avançar, a terapia direcionada se tornou mais madura. A premissa do tratamento direcionado é fazer testes genéticos nos alvos moleculares dos medicamentos para identificar mutações genéticas que causam distúrbios hereditários ou malignidades. ARMS-PCR é um novo método baseado em PCR que pode detectar inúmeras mutações pontuais de DNA. Atualmente, é um dos métodos mais essenciais e difundidos para a identificação genética personalizada de cânceres. Os benefícios de seu uso terapêutico foram bem reconhecidos por especialistas de campo.

1. Como funciona a PCR específica para alelos?
2. Como melhorar a especificidade do ARMS?
3. Quais são as características dos produtos fornecidos pela Yeasen?
4. O que são dados de desempenho do produto?
5. Como as pessoas encomendam produtos?

1. Como funciona a PCR específica para alelos?

ARMS-PCR é Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), também conhecido como Allele-Specific PCR (AS-PCR). A extensão específica do alelo é regulada para identificar o alelo do tipo selvagem e o gene mutante do tipo selvagem, e o valor do sinal de fluorescência é medido usando a técnica de sonda Taqman.
Os primers ARMS PCR são projetados com diferentes nucleotídeos na extremidade 3' dos dois primers upstream do alelo, e os dois primers são, respectivamente, específicos para o tipo selvagem e o tipo mutante. Durante a amplificação, os primers upstream que não correspondem completamente ao molde são incapazes de formar pares de bases complementares, resultando em incompatibilidades, extensão prejudicada e incapacidade de gerar produtos de PCR, enquanto os sistemas de primers que correspondem ao molde podem amplificar os produtos de PCR correspondentes. O fluoróforo na sonda Taqman pode emitir um sinal fluorescente que pode ser detectado pelo dispositivo, e o genótipo pode ser validado avaliando os dados de fluorescência.
A tecnologia ARMS tem alta sensibilidade, o limite de detecção pode atingir 100 cópias/mL, e o limite de detecção para tecido tumoral pode atingir uma taxa de mutação de 0,5%. Além disso, o ARMS é demorado e de baixo custo, e os resultados são intuitivos e fáceis de julgar. Isso ocorre porque o ARMS combinado com a tecnologia qPCR ou eletroforese requer apenas uma reação de PCR, o que leva menos tempo. Apenas os primers upstream precisam ser otimizados para a tecnologia ARMS, que tem menor custo e resultados intuitivos em comparação com a tecnologia de PCR em tempo real usando sondas MGB. Como a maior parte do DNA extraído de espécimes de tecido embebidos em parafina é fragmentada, resultados de detecção precisos não podem ser obtidos. O método ARMS é projetado para minimizar o comprimento do produto alvo, abordando assim essa dificuldade em tecido embebido em parafina. Ao mesmo tempo, o ARMS combinado com a plataforma de PCR realiza a operação em tubo fechado, que é simples de operar e não requer pós-processamento do produto, evitando assim a contaminação de produtos de amplificação ao máximo.
Teoricamente, a Taq DNA polimerase deve ser totalmente complementar ao molde restante na extremidade 3' do primer para realizar uma polimerização eficiente. No entanto, a estringência do Taq DNA é afetada por vários fatores. Em alguns casos, uma extensão pode prosseguir mesmo se a base terminal 3' do primer não for complementar ao molde. Se houver apenas uma incompatibilidade de base na extremidade 3', os primers podem ser incompatíveis e estendidos, mas a eficiência da extensão é baixa. Diferentes deslocamentos da extremidade 3' têm diferentes eficiências de extensão. Se outras bases incompatíveis forem introduzidas na extremidade 3', o número de incompatibilidades é muito grande e a extremidade 3' não pode ser estendida após um certo nível.Portanto, apenas uma incompatibilidade de base na extremidade 3' do primer não consegue distinguir adequadamente os dois alelos, resultando em resultados falso-positivos.

2. Como melhorar a especificidade do ARMS?

O foco de melhorar a especificidade de ARMS é melhorar a especificidade de extensão do primer. Uma base incompatível pode ser introduzida na 2ª ou 3ª base da extremidade 3'. As bases incompatíveis agem junto com as bases incompatíveis na extremidade 3', e no molde que não é complementar à extremidade 3', a taxa do produto de amplificação do primer é reduzida. Enquanto os primers amplificam normalmente em moldes complementares às suas extremidades 3', o tipo de bases incompatíveis dos primers depende do tipo de incompatibilidade de base na extremidade 3'.
Após os primers específicos para ARMS serem projetados, um par de sondas TaqMan para transferência de energia de ressonância de fluorescência específica de alelo é necessário. As sondas TaqMan têm dois corantes fluorescentes, a extremidade 5' é um gene fluorescente e a extremidade 3' tem um gene geral de extinção de fluorescência. Em uma sonda completa, o gene supressor e o gene fluorogênico estão espacialmente muito próximos, resultando em extinção de fluorescência. Em circunstâncias normais, a fluorescência emitida pelo fluoróforo na extremidade 5' não pode ser detectada, e apenas a fluorescência de fundo do supressor na extremidade 3' pode ser detectada. No processo de amplificação do gene alvo, tanto os primers de PCR quanto as sondas marcadas com fluorescência serão complementares à sequência alvo durante a de-OR. Quando a enzima Taq encontra uma sonda ligada de forma estável ao molde ao estender a fita do molde, a exonuclease 5'-3' da enzima Taq degradará a sonda específica ligada ao molde. O fluoróforo na sonda é separado por espaço físico, o efeito de extinção desaparece e a fluorescência é emitida. Descompassos entre sondas fracamente fluorescentes e sequências alvo reduzirão a quantidade de fluorescência liberada.

Figura 1 Conceito fundamental do ARMS-PCR

3. Quais são as características dos produtos fornecidos pela Yeasen?

O YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix é um kit baseado no conceito de bloco de amplificação que permite a genotipagem eficiente mediada por ARMS-PCR.

👍Alta seletividade: capaz de identificar diversas mutações genéticas;
👍Alta sensibilidade: primers mutantes podem detectar mutações em concentrações tão baixas quanto 0,5% em 10 ng/L de DNA;
👍Fácil de ler: os resultados são óbvios e avaliada objetivamente e é simples e descomplicado;
👍Simples de operar: é compatível com uma variedade de equipamentos de PCR, o modo de operação é padronizado e a detecção a bordo pode ser realizada em 90 minutos.

4. O que são dados de desempenho do produto?

4.1 Impacto de bloqueio de produto superior

Experimento: 5L de entrada de modelo, 10ng/L de modelo selvagem e quantidades equivalentes de plasmídeo mutante foram amplificados usando primers mutantes
Local：KRASG13D（38G>A）
Vermelho: 13755; Azul: Concorrentes

A Figura 2 demonstra que os primers do tipo selvagem amplificam tanto os modelos do tipo selvagem quanto os mutantes. De acordo com a curva de amplificação, o modelo do tipo selvagem não tem pico ou a diferença no valor de Ct entre o tipo selvagem e o mutante é de 6-8, permitindo que os genes do tipo selvagem e mutantes sejam efetivamente distinguidos.

4.2 A taxa de detecção do produto pode chegar a 0,05%

Experimento 1: Técnica de preparação padrão de automistura (50%): 50μL de DNA selvagem 10ng/μL e 50μL de 3X103 cópias do plasmídeo mutante.
Local：KRASG13D(38G>A)

Figura 3. De acordo com a curva de amplificação, o produto continua a operar efetivamente na concentração de 0,05%

Experimento 2: O padrão adquirido de 5% (50 ng/μL) foi diluído com diluente de biblioteca para 10 ng/μL, depois diluído novamente com 10 ng/μL de 293 g de DNA para 0,1% e 0,05%.
Local：L858R
Vermelho: 13755; Azul: Concorrentes

Figura 4: De acordo com a curva de amplificação, a taxa de detecção de loci contra um fundo de gDNA de tipo selvagem de 10 ng/μL pode ser tão alta quanto 0,05%, e a validação subsequente por padrões comerciais demonstra que nossos produtos têm uma excelente taxa de detecção.

4.3 Excelente estabilidade do produto

Os efeitos de amplificação e bloqueio do produto não são afetados por 10 ciclos de congelamento e descongelamento.
Experimento: vermelho: -20℃; verde: congelamento e descongelamento genuíno 5 vezes; azul: congelamento e descongelamento genuíno 8 vezes; roxo: congelamento e descongelamento genuíno 10 vezes.
Local：L858R

A Figura 5 demonstra que o congelamento e descongelamento repetidos do reagente 13755 dez vezes não tem influência em suas propriedades de amplificação e bloqueio.

Seus efeitos de amplificação e bloqueio não são afetados por 37 °C por 7 dias.
Experimento: Vermelho: -20°C; Verde e Roxo: 37°C por 7 dias.
Local：L858R

A Figura 6 demonstra que sete dias a 37°C não têm influência na ação de amplificação e bloqueio do reagente 13755.

5. Como as pessoas encomendam produtos?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., fundada em 2014, é uma empresa de alta tecnologia envolvida em P&D e produção de matérias-primas de enzimas de ferramentas e anticorpos de antígenos. Seus produtos incluem enzimas de diagnóstico molecular, proteínas e anticorpos usados ​​em produtos farmacêuticos, testes de segurança alimentar, reprodução, justiça e outras indústrias. Estamos comprometidos em fornecer aos clientes no campo das ciências biológicas produtos e serviços de alta qualidade. Os produtos que a Yeasen pode fornecer são os seguintes:

Tabela 1: Produtos fornecidos pela Yeasen