O valor Ct é uma representação crucial de resultado na PCR quantitativa fluorescente. Ele é usado para calcular diferenças em níveis de expressão gênica ou números de cópias gênicas. Então, qual intervalo de valores Ct pode ser considerado razoável na quantificação fluorescente? Como podemos garantir que os valores Ct estejam dentro de um intervalo efetivo? Hoje, vamos permitir que Xiao Yi responda a essa pergunta para todos.
O que é valor Ct?
No processo de amplificação de qPCR, o valor Ct se refere ao número de ciclos de amplificação (Cycle Threshold) em que o sinal de fluorescência do produto amplificado atinge o limite de fluorescência definido. "C" significa Cycle, e "T" significa Threshold. Em termos simples, o valor Ct é o número de ciclos que leva para o modelo inicial em qPCR atingir uma certa quantidade de produto, o que será explicado mais adiante.
Qual é a função do valor Ct?
1. Relação entre amplificação exponencial, quantidade de modelo e valor Ct
Em um cenário ideal, durante a qPCR, os genes são amplificados exponencialmente e se acumulam ao longo de um certo número de ciclos. A relação entre o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produto pode ser expressa como: a quantidade de produto amplificado = quantidade inicial do molde × (1 + En) ^ número de ciclos. No entanto, as reações de qPCR nem sempre ocorrem em condições ideais. Quando a quantidade de produto amplificado atinge uma "certa quantidade de produto", o número de ciclos neste ponto é o valor Ct, indicando o período de amplificação exponencial. A relação entre o valor Ct e a quantidade inicial do molde é a seguinte: há uma relação linear entre o valor Ct de um molde e o logaritmo do número inicial de cópias desse molde. Uma concentração maior do molde inicial resulta em um valor Ct menor, enquanto uma concentração menor do molde inicial leva a um valor Ct maior.
2. Curva de amplificação, limiar de fluorescência e uma certa quantidade de produto
A quantidade de produtos de amplificação de qPCR é diretamente representada na forma de sinais de fluorescência, que é conhecida como curva de amplificação. Nos estágios iniciais da PCR, quando a amplificação está em condições ideais e o número de ciclos é baixo, o acúmulo de produtos é mínimo, e o nível de fluorescência produzido não é significativamente distinguível do ruído de fluorescência de fundo. Posteriormente, a produção de fluorescência entra na fase exponencial. A quantidade de produto de PCR pode ser detectada em um certo ponto quando a reação está apenas entrando na fase exponencial, que é referida como a "certa quantidade de produto". Isso pode ser usado para inferir o conteúdo inicial do modelo. Portanto, a intensidade do sinal de fluorescência correspondente à certa quantidade de produto é conhecida como o limiar de fluorescência.
Nos estágios posteriores da PCR, a curva de amplificação não exibe mais amplificação exponencial e entra na fase linear e na fase de platô.
3. A reprodutibilidade dos valores de Ct
Quando os ciclos de PCR atingem o número de ciclos em que o valor Ct ocorre, ele está apenas entrando na verdadeira fase de amplificação exponencial. Neste ponto, erros menores não foram amplificados, então a reprodutibilidade dos valores Ct é excelente. Isso significa que, independentemente de o mesmo modelo ser amplificado em momentos diferentes ou em tubos diferentes ao mesmo tempo, os valores Ct obtidos permanecem constantes.
Qual é o intervalo de valores de Ct?
1.Eficiência de amplificação En
A eficiência de amplificação por PCR refere-se à eficiência com a qual a polimerase converte o gene alvo em produtos de amplificação.A eficiência de amplificação é de 100% quando uma molécula de DNA é convertida em duas moléculas de DNA. A eficiência de amplificação é comumente denotada como En. Para a conveniência da análise em artigos subsequentes, aqui está uma breve introdução aos fatores que afetam a eficiência de amplificação.
| Fatores Influenciadores | Explicação | Julgamentos |
| A. Inibidores de PCR | 1. O RNA molde pode conter substâncias que inibem a reação de PCR, como proteínas ou detergentes, entre outros. 2. O cDNA obtido após a transcrição reversa pode conter altas concentrações de RNA molde e componentes dos reagentes de transcrição reversa, o que também pode inibir a PCR subsequente. | 1. A presença de contaminação pode ser avaliada medindo as razões A260/A280 e A260/A230 ou realizando eletroforese de RNA. 2. Após a transcrição reversa, se o cDNA é diluído em uma determinada proporção. |
| B. Projeto de primer irracional | O primer não pode ser recozido de forma eficaz. | Verifique se há dímeros ou estruturas em grampo nos primers e se há incompatibilidades; às vezes é necessário prestar atenção ao design que abrange os íntrons. |
| C. Procedimento de reação inadequado | 1. Os primers não conseguem se anelar de forma eficaz. 2. A atividade da DNA polimerase não é totalmente liberada. 3. Devido a altas temperaturas prolongadas, a atividade da DNA polimerase diminui. | 1. A temperatura de recozimento é maior que o valor Tm do primer. 2. O tempo de pré-desnaturação é muito curto. 3. A duração de cada estágio do protocolo de reação é muito longa. |
| D. Reagentes não misturados completamente ou erros de pipetagem | No sistema de reação, a concentração local dos componentes da reação de PCR é muito alta ou irregular, resultando em amplificação não exponencial da PCR. | / |
| E.Comprimento do amplicon | O comprimento do amplicon é muito longo, excedendo 300 pares de bases, resultando em baixa eficiência de amplificação. | Verifique se o comprimento do amplicon está entre 80 pares de bases e 300 pares de bases. |
| F. O impacto dos reagentes qPCR | Uma concentração menor de DNA polimerase nos reagentes ou concentrações iônicas subótimas no tampão fazem com que a enzima Taq não atinja sua atividade máxima. | A curva padrão é usada para medir a eficiência de amplificação dos primers. |
2. A amplitude dos valores de Ct
O intervalo de valores de Ct é de 15 a 35. Um valor de Ct menor que 15 é considerado dentro da fase de linha de base e não atingiu o limiar de fluorescência. Idealmente, há uma relação linear entre o valor de Ct e o logaritmo do número de cópias inicial do modelo, que é conhecido como curva padrão. Usando a curva padrão, quando a eficiência de amplificação é de 100%, o valor de Ct para quantificar uma única cópia do gene é calculado em torno de 35. Se o valor de Ct for maior que 35, teoricamente, o número de cópias inicial do modelo é menor que 1, o que pode ser considerado estatisticamente insignificante.
Para genes diferentes, o intervalo de valores de Ct, devido a variações na quantidade inicial de cópias do gene e na eficiência de amplificação, requer a criação de uma curva padrão para esse gene para calcular o intervalo de detecção linear do gene.
3.Fatores que afetam os valores de Ct
Conforme indicado pela relação entre o número de ciclos de amplificação e a quantidade de produto: Quantidade do produto de amplificação = Quantidade do modelo inicial × (1 + En)^número de ciclos, pode-se ver que, sob condições ideais, a quantidade do modelo inicial e En impactarão o valor de Ct. Diferenças na qualidade do modelo ou na eficiência de amplificação podem fazer com que o valor de Ct seja muito alto ou muito baixo.
4. Valores de Ct muito altos ou muito baixos
Xiao Yi consultou os especialistas do departamento técnico da nossa empresa e resumiu as causas e soluções para os dois tipos comuns de problemas com valores de Ct para esclarecer nossos leitores.
| Problema | Causas | Soluções |
| Valor Ct muito alto | A concentração do modelo é baixa ou inibidores de PCR estão presentes. A eficiência de amplificação é baixa. | 1. Aumente a concentração do modelo; ou aumente a taxa de diluição do RNA ou cDNA; ou prepare o modelo novamente. 2. Reduza a temperatura de recozimento ou use um método de amplificação em duas etapas; certifique-se de que os componentes e o sistema estejam completamente misturados; otimize o protocolo de reação; ou tente substituir os reagentes. |
| Valor Ct muito baixo | 1. Alta concentração de modelos 2. Contaminação em NTC (No Template Control) e NRC (No Reverse Control) 3. Projeto de primer inadequado | 1. Reduza a quantidade de RNA molde; ou dilua o cDNA em uma proporção maior. 2. Substitua todos os reagentes novamente; ou use reagentes anticontaminação UDGase. 3. Otimize o procedimento para evitar amplificação não específica. |
Isso conclui a análise das causas do valor Ct anormal para esse problema. Em seguida, Xiao Yi recomendará uma gama de produtos econômicos para garantir que seus dados experimentais sejam mais precisos e confiáveis. Venha e escolha seus favoritos!
| Nome do produto | Gato# | Tamanho |
| Hieff UNICON™ Universal Azul qPCR SYBR Verde Master Mix | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ 1ª fita cDNA Synthesis SuperMix para qPCR (digestor gDNA plus) | 11141ES60 | 100 toneladas |
| Hifair™ AdvanceFast SuperMix de digestão de RT-gDNA em uma etapa para qPCR | 11151ES60 | 100 toneladas |
| Kit de síntese de cDNA Hifair™ AdvanceFast 1ª fita (sem corante) | 11150ES60 | 100 toneladas |