PCR quantitativa fluorescente (qPCR) é uma técnica comumente usada em laboratórios, que pode ser aplicada à análise de expressão gênica, genotipagem, detecção de patógenos, análise de SNP e muito mais. A operação do qPCR é simples e seu princípio é fácil de entender. Agora, diante de uma pilha de dados confusos, como analisar os resultados se torna uma tarefa assustadora. Hoje, Xiao Yi orientará você sobre como simplificar processos complexos e obter facilmente dados que podem ser publicados em periódicos SCI!
Métodos de análise comuns usados em qPCR incluem quantificação relativa e quantificação absoluta, e a escolha entre esses métodos deve ser baseada em diferentes designs experimentais. Nesta edição, focaremos em uma aplicação comum de qPCR — análise de expressão gênica, onde o método de quantificação relativa é geralmente selecionado.
Desenho Experimental
Suponha que atualmente precisamos estudar o efeito da indução de luz na expressão do gene Arabidopsis AtSUC2. O grupo de controle consistiria em plantas Arabidopsis que não passaram por nenhum tratamento, enquanto o grupo experimental seria composto por plantas que foram tratadas com uma certa indução de luz. O RNA seria extraído de ambos os grupos e transcrito reversamente para obter cDNA, que seria então usado como um molde. O gene Arabidopsis GAPDH seria selecionado como uma referência interna para o experimento qPCR.
Os poços de qPCR que precisam ser configurados são os seguintes:
1) NTC (No Template Control) é usado para verificar se há contaminação no sistema de PCR.
2) TRN (Sem transcrição reversa) refere-se ao uso de RNA que não passou por transcrição reversa como modelo, que serve como controle para contaminação de gDNA.
3) O gene de referência interna é usado para corrigir diferenças causadas por concentrações iniciais variáveis de amostras.
4) A seleção de amostras de controle geralmente se enquadra nas seguintes categorias:
- Para avaliar o efeito de um determinado tratamento na expressão genética, a amostra não tratada é usada como amostra de referência.
- Para detectar as diferenças na expressão genética em momentos diferentes, a amostra no momento 0 é usada como amostra de referência.
- Para comparar as diferenças na expressão genética entre diferentes tecidos, um tecido é selecionado arbitrariamente como amostra de referência.
Um ponto a ser observado aqui é que para cada material mencionado acima, 3 poços de PCR (1, 2, 3) foram configurados. Essas são duplicatas de PCR, também conhecidas como replicações técnicas, que visam eliminar erros operacionais e avaliar com precisão a eficiência da amplificação. Além disso, replicações biológicas precisam ser estabelecidas, o que envolve conduzir o mesmo experimento em diferentes materiais (diferentes tempos, plantas, lotes, placas de reação) para calibrar a variabilidade biológica e analisar se o tratamento tem significância estatística. Especificamente neste caso, tanto o grupo experimental quanto o grupo de controle requerem pelo menos mais dois conjuntos de amostras de Arabidopsis (A, B, C) para serem processados. O RNA é extraído de cada conjunto e transcrito reversamente, seguido por qPCR. Para análise estatística, a média das três replicações biológicas é usada.
Análise de resultados — Método ΔΔCt
A característica do método ΔΔCt é que ele depende apenas dos valores de Ct para cálculo, mas a premissa é que a eficiência de amplificação do gene alvo e do gene de referência deve ser relativamente consistente e ambos devem estar dentro da faixa de 90-110%.
A fórmula de cálculo específica é a seguinte:
ΔCt = Ct (gene alvo) - Ct (gene de referência)
ΔΔCt = ΔCt (grupo experimental) - ΔCt (grupo controle)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Assumindo o experimento acima estudando o efeito da indução de luz na expressão do gene Arabidopsis AtSUC2, os resultados da qPCR são os seguintes:
Durante o cálculo, primeiro calculamos a média dos dados de 2^-△Ct para o grupo de controle (conforme mostrado na figura acima, que é 0,00116). Então, dividimos cada valor de 2^-△Ct por essa média para obter o valor de 2^-△△Ct. Finalmente, organizamos esses valores para obter a média e o desvio padrão, indicando que o nível de expressão do gene alvo no grupo experimental é aumentado em aproximadamente 9,73 vezes em comparação ao grupo de controle.
Os resultados são plotados usando o software Graphpad da seguinte forma:
O valor de P calculado usando o teste t do software é 0,0024, que é menor que 0,05, indicando uma diferença estatisticamente significativa e os resultados são confiáveis.
Análise de resultados — Método da curva padrão dupla
Em aplicações práticas, como a eficiência de amplificação do gene alvo e do gene de referência é frequentemente diferente, é necessário redesenhar primers e otimizar as condições de reação para atingir a mesma eficiência de amplificação. No entanto, também podemos escolher um método mais conveniente, a abordagem de curva padrão dupla.
Aqui, vamos primeiro entender o método de análise de quantificação absoluta. As etapas específicas são amplificar o fragmento alvo por meio de PCR, então inserir o fragmento alvo em um vetor de clonagem, extrair o plasmídeo recombinante e, após o sequenciamento confirmar que está correto, ele pode ser usado como um padrão. A quantidade de DNA plasmídeo pode ser medida usando instrumentos como Nanodrop, e o número de cópias é convertido em cópias específicas do plasmídeo usando a fórmula de conversão do número de cópias. Depois disso, o DNA é amplificado após uma série de diluições. Uma curva padrão é plotada com o logaritmo do número de cópias padrão como o eixo x e os valores Ct medidos como o eixo y. Com base no valor Ct da amostra desconhecida, seu número absoluto de cópias pode ser calculado.
Fórmula de cálculo do número de cópias:
Número de cópias = (massa ÷ massa molecular relativa) × 6,02 × 10^23
O método de curva padrão dupla envolve construir separadamente amostras padrão para o gene alvo e o gene de referência, realizar quantificação absoluta e criar curvas padrão. Após calcular o número absoluto de cópias das amostras desconhecidas, uma comparação é feita, oferecendo assim maior precisão.
A fórmula de cálculo específica é a seguinte:
Q = Número de cópias do gene alvo / Número de cópias do gene de referência
RQ = Q (experimental) / Q (controle)
No experimento mencionado acima, que investiga o efeito da indução de luz na expressão do gene AtSUC2 de Arabidopsis, amostras padrão para AtSUC2 e GAPDH foram construídas, e as seguintes curvas padrão foram preparadas:
Os valores de Ct para o gene alvo e o gene de referência interno nas amostras a serem testadas são os seguintes:
Durante o cálculo, primeiro, os valores de Ct do gene alvo e do gene de referência interno são substituídos na relação linear da curva padrão para obter os números absolutos de cópias do gene alvo e do gene de referência interno nos grupos experimental e de controle. Então, usando a fórmula Q = número de cópias do gene alvo / número de cópias do gene de referência, o nível de expressão do gene alvo é normalizado.Por fim, de acordo com a fórmula RQ = Q (experimental) / Q (controle), o RQ é calculado como 9,71, indicando que o nível de expressão do gene alvo no grupo experimental é 9,71 vezes maior do que no grupo controle.
Os resultados são plotados usando o software GraphPad da seguinte forma:
O valor de P calculado usando o teste t do software é 0,0008, que é menor que 0,05, indicando uma diferença estatisticamente significativa e os resultados são confiáveis.
Isso conclui a análise de dados qPCR para esta sessão. Em seguida, recomendarei uma gama de produtos econômicos para garantir que seus dados experimentais sejam mais precisos e confiáveis. Venha buscá-los!
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