Apesar de ter obtido bons resultados durante a pandemia e de mostrar grande potencial, a tecnologia de mRNA ainda tem várias limitações, como tempos de expressão curtos e tradução limitada de proteínas. Embora essas características possam fornecer um certo nível de segurança, elas se tornam limitações para terapias como a reposição de proteínas. Isso requer dosagem repetida para manter os níveis de expressão de proteínas, introduzindo novos riscos e desafios, como imunogenicidade e anticorpos neutralizantes.
O RNA autoamplificador (saRNA) pode gerar a mesma resposta imune em doses centenas ou até milhares de vezes menores do que o mRNA tradicional. Doses mais baixas significam menores custos de produção, e injeções menos frequentes podem reduzir potenciais efeitos colaterais tóxicos do mRNA e vetores de entrega. Atualmente, vários candidatos a saRNA entraram em ensaios clínicos em todo o mundo. Grandes empresas como a BioNTech estão desenvolvendo ativamente pipelines de tecnologia de saRNA.
Embora o saRNA ofereça vantagens significativas de custo e segurança, sua estrutura única apresenta novos desafios de produção. A molécula de saRNA, que combina a sequência que codifica a RNA polimerase com a sequência da proteína alvo, é muito maior (~10kb) e mais complexa (contendo mais estruturas secundárias) do que o mRNA tradicional. Isso aumenta significativamente a dificuldade das reações de transcrição in vitro, reduzindo o rendimento e a pureza da produção de saRNA. Portanto, a produção de saRNA exige padrões mais elevados em processos de síntese, separação e purificação.
A cromatografia de afinidade, um método usado para separação e purificação, tem problemas como baixo rendimento e integridade do produto alvo. Combinar vários métodos de purificação cromatográfica (por exemplo, adicionar cromatografia de celulose, cromatografia de fase reversa hidrofóbica) é trabalhoso, introduz novas impurezas, tem baixas taxas de recuperação e é caro. Além disso, o sistema de reação IVT usado para produção em larga escala é otimizado a partir de sistemas adequados para sintetizar sequências de ácido nucleico de 100 nt, tornando-o inadequado para saRNA, que excede 10 kb em tamanho. Isso requer a otimização dos sistemas de reação IVT existentes. Atualmente, os métodos convencionais de purificação de mRNA não podem atender aos requisitos de qualidade de líquido bruto industrial. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver e otimizar um processo de separação e purificação de nível industrial completo e eficiente para RNA autoamplificador.
Otimização de Métodos de Produção e Purificação Industrial
Para desenvolver um sistema de produção industrial para mRNA autoamplificador (saRNA), é essencial primeiro otimizar os tipos de íons tampão e componentes no sistema de cotranscrição IVT em pequena escala. Isso também envolve refinar o tampão cromatográfico e as taxas de lavagem de amostra para processos de purificação posteriores. Essas condições otimizadas podem então ser ampliadas para produção em larga escala para verificar se o sistema pode efetivamente aumentar a capacidade de produção e melhorar a qualidade do produto bruto.
Sistema de reação de adição de cap de cotranscrição
No sistema de reação de adição de capa de cotranscrição, os componentes do tampão T7 incluem 400 mM de HEPES, 20 mM de espermidina, 100 mM de DTT e sais de Mg2+.
Tampão T7 - Tipo de sal de íon de magnésio
O tipo de sal de íon de magnésio usado afeta o rendimento e a integridade do produto saRNA alvo.
- Para síntese de cotranscrição em pequena escala de 1 mg de mRNA, o uso de Mg(OAc)2 como sal de Mg2+ resulta no melhor rendimento e integridade, com valores de 100,5 µg e 62,9%, respectivamente.
- Em contraste, o uso de outros sais de íons de magnésio, como MgCl2 e MgSO4, reduz o rendimento em aproximadamente 25-50% e a integridade em cerca de 10%, reduzindo significativamente tanto o rendimento quanto a integridade.
Tampão T7 - Concentração de íons de magnésio
Uma concentração ideal de íons de acetato de magnésio (30-50 mM) aumenta o rendimento e a integridade do saRNA alvo, com melhores resultados em 35 mM.
- Em uma concentração de íons de acetato de magnésio de 30-50 mM, o rendimento de saRNA atinge 88,5-100,5 µg e a integridade é de 58,6-62,9%, mostrando bons resultados.
- Na concentração de 35 mM, o rendimento e a integridade são os mais altos, atingindo 100,5 µg e 62,9%, respectivamente.
Tampão T7 - Sal de íon de magnésio combinado com outros sais
Adicionar outros sais ao tampão T7 pode melhorar significativamente o rendimento e a integridade do produto alvo.
- O tampão base T7 inclui 400 mM de HEPES, 20 mM de espermidina, 100 mM de DTT e sais de Mg2+, resultando em um rendimento e integridade de 100,5 µg e 62,9%, respectivamente.
- A adição de um segundo sal, NaOAc, aumenta ainda mais o rendimento e a integridade: o rendimento aumenta em 20-110 µg e a integridade melhora em cerca de 2-8%.
Tampão T7 - Concentração de Sais Combinados
Quando o segundo componente salino NaOAc (Na+) está em uma concentração de 5-30 mM, o rendimento e a integridade do saRNA alvo melhoram significativamente, com a melhor concentração em 15 mM.
- Em concentrações de Na+ de 3-30 mM, o rendimento de saRNA atinge 120-210 µg e a integridade é de 64,4-70,2%, apresentando bons resultados.
- Em uma concentração de Na+ de 15 mM, o rendimento e a integridade estão no máximo, atingindo 210 µg e 70,2%, respectivamente.
Métodos de purificação única
Durante a produção e purificação de saRNA em pequena escala (<50 mg), o uso de diferentes métodos de purificação pode reduzir significativamente o conteúdo de dsRNA e resíduos de proteína, garantindo alto rendimento, eficiência de cobertura e integridade do produto. A eficácia dos métodos de purificação do melhor ao pior é: cromatografia de afinidade > precipitação de cloreto de lítio > ultrafiltração, cromatografia de celulose.
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Cromatografia de afinidade
Para produção de mRNA em larga escala, a cromatografia é preferida. As opções incluem cromatografia de fase reversa, troca iônica, hidrofóbica e de afinidade, cada uma com seus prós e contras. A cromatografia de afinidade, frequentemente usada para capturar mRNA poli(A), oferece soluções de escalabilidade e plataforma com taxas de recuperação >90%.
As principais características estruturais do mRNA, a capa 5' e a cauda poli(A) 3', facilitam a purificação. A cromatografia de afinidade, semelhante à purificação de esferas magnéticas, usa esferas ligadas a dT para capturar o mRNA da cauda poli(A). Condições de alto teor de sal protegem as cargas negativas, permitindo a ligação por meio de ligações de hidrogênio AT, e o mRNA é eluído sob pH neutro suave e baixa condutividade.
A cromatografia de afinidade para RNA envolve "alta ligação de sal, baixa eluição de sal". A composição do tampão, o tamanho molecular, a temperatura e a concentração da amostra impactam significativamente o processo. Selecionar o tipo e a concentração de sal ideais por meio de experimentação é essencial para uma purificação eficiente.
Purificação: Este método produz a maior integridade do produto (80,3%), o menor teor de dsRNA (0,01 µg/mg), a maior eficiência de encapsulamento (96,4%) e o menor número de resíduos de proteína (1,20 µg/mg), com um rendimento de 136 µg e uma taxa de recuperação de 65%, tornando-o o melhor em termos de pureza e qualidade do produto.
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Outros métodos de purificação:
Precipitação de cloreto de lítio
O princípio da purificação de mRNA usando LiCl é que o lítio pode reduzir a repulsão eletrostática entre moléculas em um determinado pH, permitindo a precipitação eficiente de RNA.O precipitado é então separado por centrifugação, dissolvido para obter uma amostra de RNA puro. A precipitação com LiCl é simples, rápida, eficaz para mRNAs de vários tamanhos e produz produtos de alta pureza. No entanto, íons de lítio residuais podem inibir o mRNA. É recomendado usar precipitação com LiCl para soluções contendo pelo menos 400 µg/ml de RNA para garantir a eficiência da purificação. Este método produz um alto rendimento (210µg), mas a integridade do produto é de apenas 70,2%, reduzindo significativamente a qualidade do produto. Não é adequado para produção em larga escala.
Método de esfera magnética:
Esferas magnéticas são pequenas partículas que se movem direcionalmente sob um campo magnético, tipicamente compostas de um núcleo de óxido de ferro e um revestimento externo. A purificação de esferas magnéticas é uma técnica comum de biologia molecular para enriquecer moléculas de mRNA de misturas de forma rápida e eficiente. Diferentes esferas magnéticas funcionais têm diferentes grupos funcionais de superfície (por exemplo, hidroxila, carboxila, Oligo(dT), estreptavidina) para purificar várias biomoléculas.
As esferas magnéticas carboxiladas podem purificar eficientemente ácidos nucleicos, com moléculas de mRNA se ligando por meio de interações eletrostáticas sob condições ácidas. O ajuste das condições permite a ligação e liberação seletivas de mRNA. Os mRNAs mais longos com grupos fosfato carregados negativamente mais expostos se ligam mais facilmente às esferas. Para mRNAs mais curtos, volumes maiores de esferas podem ser necessários. As esferas magnéticas acopladas a Oligo(dT), semelhantes à cromatografia de afinidade, utilizam ligação específica entre a cauda poli(A) do mRNA e o Oligo(dT) das esferas.
Ultrafiltração
Este método resulta na menor integridade de saRNA, aproximadamente 8% menor que a cromatografia de afinidade, com o maior resíduo de proteína (4,58 µg/mg).
Cromatografia de Celulose
Este método atinge baixo conteúdo de dsRNA (0,009 µg/mg) e uma alta taxa de capping (96,4%). No entanto, os resíduos de proteína são ligeiramente maiores (5,30 µg/mg), com uma taxa de recuperação de apenas 57% e um rendimento de 120 µg, ambos significativamente menores do que aqueles alcançados com cromatografia de afinidade (em cerca de 10% e 16 µg, respectivamente).
Processo de purificação
Componentes do Tampão Cromatográfico - Adição de Agentes Redutores
Adicionar agentes redutores ao tampão cromatográfico durante a purificação pode melhorar significativamente a integridade do produto, a taxa de recuperação e a eficiência de encapsulamento, ao mesmo tempo em que reduz os níveis de subprodutos dsRNA e resíduos de proteínas em comparação com a não adição de agentes redutores.
- Sem agentes redutores:
- Rendimento: 136µg
- Taxa de recuperação: 65%
- Integridade: 80,3%
- dsRNA: 0,01 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 1,20µg/mg
- A pureza e a qualidade do produto são boas.
- Com agentes redutores (TCPE, DTT, β-mercaptoetanol):
- O rendimento aumenta em 10-40µg
- A taxa de recuperação aumenta em 5-18%
- A integridade melhora em aproximadamente 1-5%
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- dsRNA: tão baixo quanto 0,005 µg/mg
- Resíduo de proteína: tão baixo quanto 0,20 µg/mg
- Melhoria significativa na pureza e qualidade do produto.
Componentes do tampão cromatográfico - Tipos de agentes redutores
Diferentes tipos de agentes redutores adicionados ao tampão cromatográfico podem melhorar ainda mais a integridade do produto, a taxa de recuperação e a eficiência de cobertura, ao mesmo tempo em que reduzem resíduos de dsRNA e proteína. TCPE é considerado o agente redutor mais eficaz.
- Com TCPE:
- Rendimento: 175µg
- Taxa de recuperação: 83%
- Integridade: 85,2%
- dsRNA: 0,005 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 0,20µg/mg
- Excelente pureza e qualidade do produto.
Componentes do Tampão Cromatográfico - Concentração de Agentes Redutores
Adicionar agentes redutores em uma concentração de 5-15 mM no tampão cromatográfico pode melhorar significativamente a integridade do produto, a taxa de recuperação e a eficiência de cobertura, ao mesmo tempo em que reduz resíduos de dsRNA e proteína. A concentração ótima é de 10 mM.
- Adicionando 5-15 mM TCPE:
- Rendimento: 160-178µg
- Taxa de recuperação: 76-85%
- Integridade: aproximadamente 85%
- dsRNA: 0,002-0,005 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 0,20-0,52µg/mg
- Boa pureza e qualidade do produto.
- Com 10 mM TCPE:
- Rendimento: 178µg
- Taxa de recuperação: 85%
- Integridade: 85,4%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 0,20µg/mg
- Pureza e qualidade ideais do produto.
Proporção de lavagem
Controlar a proporção de tampão cromatográfico para água de injeção no processo de lavagem (10-25):(75-90) pode melhorar significativamente a integridade do produto, a taxa de recuperação e a eficiência de encapsulamento, ao mesmo tempo em que reduz resíduos de dsRNA e proteína. A proporção ideal é 15:85.
- Proporção (10-25):(75-90):
- Rendimento: 150-179µg
- Taxa de recuperação: 71-85%
- Integridade: 84-90%
- dsRNA: 0,002-0,006 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: aproximadamente 0,20µg/mg
- Boa pureza e qualidade do produto.
- Com proporção 15:85:
- Rendimento: 179µg
- Taxa de recuperação: 85%
- Integridade: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 0,20µg/mg
- Pureza e qualidade ideais do produto.
Métodos de purificação combinados
Usar uma combinação de diferentes métodos de purificação pode reduzir ainda mais os níveis de resíduos de dsRNA e proteína no produto, melhorando a qualidade geral. A ordem preferida de métodos de purificação é: cromatografia de afinidade > ultrafiltração + cromatografia de afinidade > cromatografia de afinidade + cromatografia de celulose > cromatografia de celulose + ultrafiltração. A cromatografia de afinidade sozinha fornece os melhores resultados.
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Cromatografia de afinidade sozinha:
- Rendimento: 179µg
- Taxa de recuperação: 85%
- Integridade: 90,0%
- dsRNA: 0,002 µg/mg
- Eficiência de Limitação: 96,4%
- Resíduo de proteína: 0,20µg/mg
- Máxima pureza e qualidade do produto.
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Ultrafiltração + Cromatografia de Afinidade:
- Rendimento: 170µg (9µg a menos que a cromatografia de afinidade sozinha)
- Taxa de recuperação: 81% (4% menos que a cromatografia de afinidade sozinha)
- Integridade: 88,5%
- dsRNA: 0,0015 µg/mg
- Resíduo de proteína: 0,18µg/mg
- Ligeira redução em resíduos de dsRNA e proteína em comparação à cromatografia de afinidade sozinha, mas redução significativa no rendimento e na taxa de recuperação. Este método é mais complexo, dobrando o tempo de purificação e aumentando os custos.
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Cromatografia de afinidade + cromatografia de celulose / cromatografia de celulose + ultrafiltração:
- dsRNA: 0,005 µg/mg menor que métodos únicos
- Rendimento: 60-100µg menos
- Taxa de recuperação: 30-40% menor
- Degraus maiores resultam em maiores custos de mão de obra e material.
Produção em larga escala
Na produção em larga escala, usando cromatografia de afinidade, cromatografia de afinidade combinada com cromatografia de celulose ou ultrafiltração combinada com cromatografia de afinidade, o rendimento do mRNA autoamplificador aumenta significativamente para 140-185 µg, com uma taxa de recuperação de 67-88%. A integridade do produto é de 93-94%, o conteúdo de dsRNA é controlado dentro de 0,0018-0,0020 µg/mg, a eficiência de cobertura atinge 96,1-96,4% e os resíduos de proteína são mantidos dentro de 0,04-0,05 µg/mg. Isso demonstra boa escalabilidade e eficiência para produção em larga escala.
Referência:
[8] Produção Industrial e Métodos de Purificação de Separação de Líquido Bruto de mRNA Autoamplificador e Suas Aplicações [P]. Patente: CN118048418A. 2024.05.17.
Informações para pedidos
| Nome do produto | SKU | Especificações |
| CleaScrip™ T7 RNA Polimerase (RNA de baixa ds, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| T7 RNA polimerase grau GMP (50 U/μL) | 10624ES | 5000/50000 U |
| T7 RNA polimerase grau GMP (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
| 10×Tampão de transcrição 2 grau GMP | 10670ES | 1/10 mL |
| Pirofosfatase, grau GMP inorgânico 0.1 U/μL) | 10672ES | 10/100/1000 U |
| Inibidor de RNase murina grau GMP | 10621ES | 20/10/100 KU |
| BspQI grau GMP | 10664ES | 500/2500 U |
| DNase I Grau GMP | 10611ES | 500/2000/10000 U |
| Solução de sódio N1-Me-Pseudo UTP (100 mM) | 10651ES | 100 μL/1 mL |
| Limpador de RNA Hieff NGS™ | 12602ES | 1/5/60/450 mL |
| Solução ATP Tris grau GMP (100 mM) | 10652ES | 1/5/25/500 ml |
| Solução CTP Tris grau GMP (100 mM) | 10653ES | 1/5/25/500 ml |
| Solução GTP Tris grau GMP (100 mM) | 10655ES | 1/5/25/500 ml |
| Solução Pseudo UTP Tris grau GMP (100 mM) | 10656ES | 1/5/25/500 ml |
| Solução N1-Me-Pseudo UTP Tris grau GMP (100 mM) | 10657ES | 1/5/25/500 ml |
| ARCA (Anti Reverse Cap Analógico) | 10681ES | 1/5/25/500 ml |
| Kit ELISA de RNA fita dupla (dsRNA) | 36717ES | 48T/96T |