A estrutura Cap é um componente essencial no desenvolvimento de vacinas e terapêuticas de mRNA. A tecnologia de mRNA sintético depende do Cap1 para aumentar a estabilidade, a eficiência translacional e reduzir o reconhecimento imunológico inato do mRNA por receptores toll-like (TLRs) e outros sensores imunológicos, minimizando a ativação imunológica indesejada. Isso previne respostas inflamatórias indesejadas, melhorando assim a estabilidade e a eficácia do mRNA terapêutico em células humanas.
Descoberta inicial e estrutura Cap0
Em meados da década de 1970, a pesquisa sobre mRNA eucariótico revelou uma estrutura terminal 5' agora conhecida como Cap0, onde uma capa de N7-metilguanosina (m7G) é anexada ao primeiro nucleotídeo na extremidade 5'. Descobriu-se que essa modificação protege o mRNA da degradação por exonucleases, auxilia na exportação nuclear e promove o reconhecimento do ribossomo para o início da tradução. Cap0 foi a primeira estrutura de capa caracterizada, com sua metilação limitada à própria capa de guanosina. A descoberta dessa capa 5' e suas funções marcaram um avanço significativo na compreensão das capas de mRNA eucarióticas e seu papel nas modificações de mRNA.
O surgimento do Cap1
A estrutura Cap1, uma característica crítica do mRNA eucariótico, desempenha um papel fundamental na estabilidade do mRNA, tradução e reconhecimento imunológico. A estrutura cap do mRNA, consistindo de uma N7-metilguanosina (m7G) ligada ao primeiro nucleotídeo por meio de uma ligação trifosfato 5'-5', evoluiu de estudos iniciais sobre modificações pós-transcricionais do mRNA eucariótico na década de 1970.
Estrutura de mRNAs com terminação 5'.【1】 Investigações posteriores revelaram que na maioria dos mRNAs eucarióticos, o primeiro nucleotídeo após a terminação (posição +1) também é metilado na posição 2'-O da ribose, um processo conhecido como 2'-O-metilação. Esta descoberta, conhecida como estrutura Cap1 (m7GpppNm), adicionou outra camada de significância funcional às modificações do mRNA. Descobriu-se que a modificação Cap1 ajustava a estabilidade do mRNA e prevenia o reconhecimento imunológico pelo sistema imunológico inato, particularmente em células de mamíferos, onde ajuda a evitar o reconhecimento por receptores de reconhecimento de padrões como RIG-I, TLRs e MDA5【2】. Isso foi crucial tanto para o metabolismo do mRNA quanto para o avanço das tecnologias baseadas em mRNA, incluindo vacinação de mRNA e aplicações de terapia genética.
Desafios técnicos na indústria de mRNA e soluções atuais
Vários desafios técnicos permanecem na aplicação e otimização generalizadas de vacinas de mRNA, incluindo problemas com mRNA de alta dose, respostas imunes, estabilidade e entrega. Um desafio significativo na indústria de mRNA é a necessidade de altas doses de mRNA para provocar uma resposta imune robusta. Isso se deve a vários fatores:
Degradação rápida: O mRNA é inerentemente instável e suscetível à degradação por enzimas de decapagem e ribonucleases (RNases) presentes em sistemas biológicos.
Eficiência translacional limitada: A eficiência com que o mRNA é traduzido em proteína pode variar, exigindo maiores quantidades de mRNA para gerar níveis de antígeno suficientes para uma resposta imune. A eficiência da tradução está relacionada à afinidade do Cap1 e do fator de iniciação da tradução eIF4E.
A formação do complexo básico de iniciação da tradução em eucariotos.【3】
Imunogenicidade e reações imunológicas indesejadas: O terceiro maior obstáculo é a resposta imune inata que pode ser desencadeada pelo próprio mRNA, especialmente para dsRNA ou mRNA incompleto. Embora um certo nível de ativação imune seja desejado para estimular o sistema imune adaptativo, a ativação excessiva pode levar a respostas inflamatórias, o que pode reduzir a eficácia da vacina ou causar efeitos colaterais.
História da Tecnologia de Capping
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Tecnologia de encapsulamento enzimático: O capping enzimático, introduzido nos primeiros dias da pesquisa de mRNA, envolve o uso de enzimas de capping como guanililtransferase e metiltransferase para adicionar um cap 5' natural pós-transcricionalmente. Este método garante alta fidelidade e eficiência de capping na tradução de mRNA, particularmente para aplicações terapêuticas.
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Análogos de boné sintético (décadas de 1980 a 2000): Pesquisadores desenvolveram análogos de cap sintéticos para síntese in vitro de mRNA capeado, ajudando a estudar a função do mRNA e a expressão genética. O Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) é um análogo de cap sintético projetado para evitar a incorporação incorreta de cap durante a síntese de mRNA, melhorando a eficiência da tradução de mRNA para vacinas e terapias genéticas. No entanto, a eficiência de capping e o rendimento do capping ARCA são baixos.
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Tecnologia Cap1 (década de 2010): O Cap1 da TriLink é um método de capping cotranscricional que simplifica o processo ao incorporar o cap diretamente durante a síntese de mRNA. Este método aumenta a eficiência e produz uma alta porcentagem de mRNA corretamente capeado, tornando-o ideal para aplicações terapêuticas em larga escala, como vacinas de mRNA.
Atualmente, as tecnologias de encapsulamento enzimático têm sido essenciais no desenvolvimento de terapias baseadas em mRNA, incluindo vacinas contra a COVID-19, garantindo a estabilidade e a tradução eficaz do mRNA terapêutico.
Comparação de Enzymatic capping, a próxima geração LZCap Capping e o método de Capping de primeira geração (ARCA)
Desenvolvendo análogos de bonés de última geração
Nosso objetivo era desenvolver análogos de cap com resistência a enzimas de decapeamento, alta afinidade para eIF4E para melhorar a eficiência da tradução e menor imunogenicidade. Esses avanços são cruciais para aumentar a eficácia das terapias baseadas em mRNA, incluindo tratamentos anticâncer e aplicações de terapia genética.
Projetando LZCap
Ao projetar o LZCap, focamos principalmente na criação de um análogo de cap com alta afinidade para eIF4E. As enzimas têm um reconhecimento relativamente "específico" de substratos. Portanto, ao projetar uma nova estrutura de cap, nos esforçamos para manter a similaridade com estruturas naturais/conhecidas tanto quanto possível. A estrutura natural tem uma ribose 3' OH, que pode ser modificada (por exemplo, metilação). Com base nessa consideração, escolhemos adicionar um carbono na posição 3' para novidade, seguido por um NH para imitar a ligação de hidrogênio de OH e, em seguida, um grupo acetil para reduzir a basicidade de NH e aumentar sua capacidade de ligação de hidrogênio. A atividade do LZCap é melhor do que a cap natural metilada, possivelmente devido ao aumento da ligação de hidrogênio. Comparado aos grupos metil e metoxi, o grupo acetil amino também pode aumentar as interações de van der Waals entre o substrato (cap) e o fator iniciador (enzima).
Estabilidade do grupo acetil amino
O grupo acetil amino já é suficientemente estável. Ele é muito mais estável do que a posição 7-metilada e a ligação fosfodiéster, que são as partes menos estáveis do cap.
Rendimento e eficiência de cobertura do LZCap
Com o cap LZCap AG(3'Acm), a eficiência de capping do mRNA da luciferase é de cerca de 97,59%, e até 200 μg de mRNA capeado podem ser obtidos com 1 μg de molde de DNA em uma reação padrão de transcrição in vitro (IVT) com a RNA polimerase T7. A pureza do mRNA é de até 99% após precipitação simples de LiCl. Essa alta eficiência de capping e rendimento tornam o LZCap uma opção atraente para várias aplicações, incluindo produção de proteínas e terapia genética.
A estrutura Cap é um componente essencial no desenvolvimento de vacinas e terapêuticas de mRNA.A tecnologia de mRNA sintético depende do Cap1 para aumentar a estabilidade, a eficiência translacional e reduzir o reconhecimento imunológico inato do mRNA por receptores toll-like (TLRs) e outros sensores imunológicos, minimizando a ativação imunológica indesejada. Isso previne respostas inflamatórias indesejadas, melhorando assim a estabilidade e a eficácia do mRNA terapêutico em células humanas.
| Produto | Boné AG (3'-OEu-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (sem limitação) |
| Rendimento de mRNA (µg) | 164 | 173 | 200 |
Análise de MS da eficiência de capping do mRNA da LZCapped Luciferase com método baseado em RNAse H. A eficiência de capping é de cerca de 97,59%,
Como é a estabilidade do mRNA em relação à enzima de decapagem?
Os mRNAs com LZCap AG(3'Acm) e LZCap AG M6 (3'Acm) mostram maior resistência à enzima de descapeamento (NEB). É notado que CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) também é resistente à enzima de descapeamento, mas o Cap AG regular (3'-OMe-7mG) não mostra resistência.
Qual é a afinidade de ligação do LZCap ao eIF4E?
E quanto à expressão proteica do mRNA encapsulado em LZCap AG(3'Acm)?
A expressão do mRNA da luciferase LZCap AG(3'Acm) capped é significativamente maior do que a do mRNA capped análogo Cap1 (3'-OMe-7mG) em diferentes linhagens celulares* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T e Huh7). O experimento de 130 repetições mostrou uma expressão cerca de 1,5 vezes maior do mRNA da luciferase LZCap AG(3'Acm) capped do que o mRNA capped (3'-OMe-7mG) em média. Resultado semelhante é observado em camundongos. O nível de expressão da proteína pode variar ligeiramente com diferentes sequências de mRNA.
Você tem mais dados sobre animais?
A eficiência de expressão de LZCap AG(3'Acm) ou LZCap AG(3'FMom) capped
O mRNA codificador de GLuc mostra uma expressão in vivo maior em relação aos mRNAs encapsulados em CapAG (3'-OMe-7mG) em macacos e porcos Cynomolgus.
E quanto à imunogenicidade inata dos mRNAs encapsulados em LZCap AG?
Os mRNAs encapsulados em LZCapAG (3'Acm) mostram baixa imunogenicidade inata. TLR8, TLR7, IL-1A e B desempenham um papel importante na resposta imune induzida por RNA desencapsulado. Os estudos in vivo da análise de imunogenicidade do mRNA LZCapped mostraram que o RNA desencapsulado causou mudanças significativas no nível de transcrição de fatores relacionados ao sistema imunológico em camundongos. Ambos os mRNAs encapsulados em LZCap e 3'-OMe-7mG exibem nível de transcrição de fator imunológico similarmente menor em camundongos após uma única injeção estimulada por RNA.
Você fez algum teste de segurança?
Sim, fizemos Teste de Citotoxicidade, Estudo de Inibição da Polimerase Humana e Teste de Ames.
- Não há ou há pouca citotoxicidade observada para o monômero nucleosídeo de 3'-Acm-7mG（CC50＞10000nM）em células 293T、Huh7、MRC5、THP1 e U87MG.
- DNA polimerase humana (α, β, gama e Klenow) e estudos de inibição da atividade da RNA polimerase mitocondrial (hPOLRMT) mostram que 3'-Acm-7mG TP não inibe a DNA humana ou a RNA polimerase.
- O teste de mutação reversa bacteriana (Ames) detecta alterações genéticas associadas, bem como carcinógenos genotóxicos na maioria dos roedores e humanos. O teste de Ames mostrou que 3'-Acm-7mG não tem genotoxicidade.
Este produto foi patenteado?
Sim. A patente foi concedida nos EUA.
Informações para pedidos
| Nome do produto | Especificações | Nº de catálogo. |
| LZCap AG(3'Acm)（ (100 mM) | 100μL, 1mL | 10684ES |
| LZCap UA(3'Acm)（ 100 milímetros） | 100μL, 1mL | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ (100 mM) | 100μL, 1mL | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 milímetros） | 100μL, 1mL | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)（ 25 milímetros） | 100μL, 1mL | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100μL, 1mL | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotina) (25 mM) | 100μL, 1mL | Investigação |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100μL, 1mL | Investigação |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
| LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100μL, 1mL | Investigação |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100μL, 1mL | EUinquérito |
Referência:
- Mecanismos moleculares de encapsulamento e metilação do RNA do coronavírus, Virologica Sinica 31(1)
- Vacinas de mRNA — uma nova era na vacinologia. Rev. Nacional. Descoberta de Drogas. 17, 261–279 (2018).
- Iniciação da tradução regulada pela proteína de ligação ao RNA em mamíferos: a modulação do complexo de iniciação da tradução por fatores de ação trans, células 2021, 10(7), 1711