Conquista revolucionária de Yeasen e biotecnologia Molefuture

Com o rápido desenvolvimento da biotecnologia, a terapia de mRNA, como um método de tratamento emergente, atraiu muita atenção devido à sua forte programabilidade e rápida velocidade de resposta. Em campos como vacinas de mRNA e terapia genética, a síntese eficiente de mRNA de alta qualidade é um passo crucial para atingir objetivos terapêuticos. Nesse processo, a RNA polimerase T7 desempenha um papel crucial, pois pode catalisar eficientemente a síntese in vitro de mRNA.

A questão do subproduto dsRNA da RNA polimerase T7

Embora a RNA polimerase T7 desempenhe um papel importante na síntese de mRNA, a operação real frequentemente resulta na produção de RNA fita dupla (dsRNA) como um subproduto. A presença de dsRNA não apenas reduz o rendimento e a pureza do mRNA, mas também pode desencadear respostas imunes não específicas, afetando a eficácia e a segurança. Portanto, reduzir a produção de dsRNA se tornou uma necessidade urgente na indústria. Atualmente, os métodos para reduzir dsRNA incluem principalmente otimizar as condições de reação e usar enzimas auxiliares. Embora esses métodos possam reduzir a produção de dsRNA até certo ponto, eles geralmente vêm com problemas como operação complexa e custos aumentados.

Por que deveríamos fazer engenharia da RNA polimerase T7?

Modificar diretamente a RNA polimerase T7 para reduzir a produção de dsRNA é uma solução mais fundamental. Técnicas de evolução direcionadas por enzimas podem melhorar suas propriedades catalíticas e aumentar a pureza e o rendimento dos produtos alterando precisamente a sequência de aminoácidos ou a estrutura da enzima. Para a RNA polimerase T7, a modificação direcionada pode não apenas reduzir a produção de dsRNA, mas também aumentar a eficiência geral e a qualidade da síntese de mRNA.

Como fornecedora de matérias-primas para síntese in vitro de mRNA, a Yeasen Biotecnologia e sua subsidiária Molefuture Biotecnologia, ter desenvolveu uma nova RNA polimerase T7—utilizando a plataforma de evolução direcionada ZymeEditor. Para minimizar a produção de subprodutos como dsRNA durante processos de transcrição in vitro, a equipe de evolução projetou a RNA polimerase T7 por meio de uma combinação de design racional e triagem direcionada.

Como o dsRNA é gerado?

De acordo com relatos da literatura, a produção do subproduto dsRNA origina-se principalmente de duas fontes (Figura 1): A primeira é durante a transição da RNA polimerase T7 da conformação de iniciação para a conformação de alongamento nos estágios iniciais da transcrição, o complexo ternário de transcrição é propenso à dissociação [1], resultando na liberação de um grande número de cadeias curtas de RNA (RNA abortivo) com comprimentos em torno de 20 nt no sistema. Essas cadeias de RNA agem como "primers", pareamento complementar com longas cadeias de RNA e se estendem para produzir dsRNA sob a ação da atividade de RNA polimerase dependente de RNA da RNA polimerase T7 (atividade RDRP) [2,3]. A segunda fonte é desencadeada pela atividade de transferência de ribonucleotídeo terminal possuída pela RNA polimerase T7. Quando a reação de transcrição atinge o final do molde linear, a RNA polimerase T7 pode adicionar aleatoriamente vários ribonucleotídeos sem dependência do molde. Esses ribonucleotídeos, formando "primers aleatórios", podem se dobrar inversamente e parear complementarmente com a região alvo do mRNA, estendendo-se para produzir dsRNA. O dsRNA produzido através do looping é chamado de dsRNA loopback [3,4]. Portanto, para reduzir os subprodutos do dsRNA, o foco da modificação da RNA polimerase T7 está na estabilização do complexo ternário de transcrição inicial ou no enfraquecimento da atividade de transferência terminal e da RNA polimerase dependente de RNA (RDRP). atividade da RNA polimerase T7.

Figura 1. Diagrama esquemático da barreira de energia e princípio de formação de dsRNA (dados não publicados)

Como superar barreira de energia da RNA polimerase T7 transição conformacional?

Por meio da análise estrutural e de energia livre, a equipe, por um lado, descobriu que, junto com as mudanças conformacionais da RNA polimerase T7, também há uma mudança na energia. A energia livre da conformação de alongamento é significativamente maior do que a da conformação de iniciação, indicando que o processo de transcrição precisa superar uma barreira de energia mais alta para produzir cadeias de mRNA completas. Uma barreira de alta energia é desfavorável para uma transição conformacional suave. Portanto, a equipe utilizou racional métodos de triagem para identificar mais de 20 aminoácidos de ponto crítico e construir bibliotecas de mutagênese de saturação correspondentes.

Como modificar o transferência terminal e atividades RDRP da RNA polimerase T7

Por outro lado, considerando os relatórios limitados sobre as funções, sítios e domínios estruturais relacionados à transferência terminal e atividades RDRP da RNA polimerase T7, e porque essas duas atividades, que são funcionalmente semelhantes, provavelmente compartilham sítios-chave com a reação principal da RNA polimerase T7 — atividade de transcrição (ou seja, atividade de polimerização de RNA dependente de DNA, DDRP) — é difícil encontrar aminoácidos de hotspot para modificação direcionada ao sítio. Portanto, a equipe construiu simultaneamente várias bibliotecas de mutação aleatória com base em PCR propensa a erros, combinadas com a capacidade de evolução de alto rendimento da plataforma ZymeEditor, resultando em uma diversidade superior a 10^6 para cada biblioteca individual.

Descoberta baseada em sonda de ideal T7 RNA polimerase

Para equilibrar a produção da RNA polimerase T7 e monitorar o conteúdo de dsRNA na reação de transcrição in vitro, a equipe, com referência a modelos de transcrição otimizados, projetou cuidadosamente múltiplos fluorescentes sondas que visam diferentes regiões dos produtos de mRNA alvo. Essas sondas associam informações como rendimento de reação, integridade e conteúdo de dsRNA dentro do sistema com sinais de fluorescência. Quanto mais forte a intensidade de fluorescência do sistema, mais vantajoso é o desempenho do mutante. Em teoria, esse método de triagem pode classificar mutantes com base na intensidade de fluorescência de diferentes sondas, obtendo mutantes de RNA polimerase T7 com alto rendimento ou RNA abortivo reduzido, bem como mutantes com integridade melhorada ou dsRNA de loopback reduzido. Quando o molde de reação é substituído por RNA, mutantes com atividade RDRP reduzida também podem ser rastreados negativamente, melhorando a seletividade do molde da RNA polimerase T7. Além disso, adicionando nucleotídeos modificados, análogos de cap e aumentando a temperatura de reação no sistema de reação de gotículas, uma triagem adicional pode ser conduzida para selecionar mutantes de RNA polimerase T7 que toleram substratos não naturais e exibem estabilidade térmica melhorada.

Como fazer a melhor triagem T7 RNA polimerase?

Com base no tamanho das bibliotecas, a equipe desenvolveu processos de triagem de ultra-alto rendimento baseados em triagem de gotículas ativadas por fluorescência (FADS) e processos de triagem de alto rendimento baseados em métodos tradicionais de microplacas (MTPS).Por meio de várias rodadas de experimentos, mais de 10^7 mutantes foram rastreados no total, resultando em vários mutantes com conteúdo de dsRNA significativamente reduzido. Entre eles, alguns mutantes mostraram uma diminuição no dsRNA causado pelo RNA Abortivo na reação, sugerindo que a conformação de alongamento desses mutantes de polimerase é mais estável. Alguns mutantes mostraram uma diminuição no conteúdo de dsRNA de loopback na reação, indicando um enfraquecimento da atividade de transferência terminal ou atividade RDRP nesses mutantes.

Dado que as vantagens de desempenho dos mutantes acima mencionados decorrem de mecanismos diferentes, a equipa construiu bibliotecas de embaralhamento de DNA visando-os. Após a triagem, a equipe finalmente obtivemos mutantes de desempenho superior com geração de dsRNA extremamente baixa, sem afetar os rendimentos e a integridade do mRNA (Figura 2). No entanto, os rendimentos de um mutante G47A+884G descoberto pela Moderna foram afetados^[5] (não publicado).

Figura 2. Processo de evolução enzimática e caracterização do desempenho mutante

(não publicado)

Análise da geração de dsRNA por T7 RNA polimerase variantes?

Após análise quantitativa, conforme mostrado na Figura 3, usando um modelo de transcrição de 9 kb sob condições de co-transcrição, a RNA polimerase T7 de tipo selvagem produziu aproximadamente 2,9 ng/μg de dsRNA ao usar nucleotídeos naturais, enquanto um comercial Enzima T7 produziu cerca de 0,18 ng/μg de dsRNA. No entanto, a produção de dsRNA de cada variante da RNA polimerase T7 construído foi inferior a 0,10 ng/μg. Particularmente, um variante foi de apenas 0,015 ng/μg, quase 200 vezes menor que o tipo selvagem e 12 vezes menor que o comercial produto. Após testes repetidos, a vantagem de desempenho das variantes na redução de dsRNA foi consistentemente observada sob diferentes condições de reação, indicando boa compatibilidade do sistema desses mutantes e estabelecendo uma base para reduzir ainda mais a produção de dsRNA por meio do tampão de reação otimização. Além disso, a triagem FADS também obteve múltiplas variantes com integridade do produto e estabilidade térmica aprimoradas, o que pode atender aos requisitos de uma gama mais ampla de aplicações de transcrição in vitro

Figura 3. Avaliação da geração de dsRNA por variantes da RNA polimerase T7 avaliadas usando o kit Yeasen Double-stranded RNA (dsRNA) ELISA e análise de dot blot do anticorpo J2.

Atualmente, vários parceiros já testaram as variantes da RNA polimerase T7 e recebemos muitos elogios deles. O uso da nova enzima simplifica o processo de purificação de mRNA, melhora a eficiência do trabalho e demonstra excelente desempenho em diversos cenários de aplicação.

Essas variantes estão em pedidos de patente e acolhemos discussões para cooperação tecnológica e licenciamento.

Sobre a Molefuture Biotechnology

A Molefuture Biotechnology é uma subsidiária da Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., especializada em fornecer soluções personalizadas de modificação enzimática impulsionadas pela tecnologia de evolução enzimática.Aproveitando os recursos de Yeasen Biotecnologia, a Molefuture opera em seis grandes plataformas tecnológicas: a inovadora plataforma de evolução enzimática ZymeEditor, uma plataforma de expressão de alta eficiência multi-host, plataforma de desenvolvimento de processo de fermentação, plataforma de desenvolvimento de processo de purificação, plataforma de produção de enzima ultralimpa e plataforma de análise e controle de qualidade de enzima. Com essas seis plataformas tecnológicas, a Molefuture pode oferecer um conjunto completo de soluções personalizadas, incluindo evolução direcionada por enzima, desenvolvimento de nova enzima, desenvolvimento de processo enzimático e produção em escala de nível GMP para atender às demandas de aplicação de enzimas em áreas como diagnóstico in vitro, biomedicina, biologia sintética, estética médica, intermediários farmacêuticos, et. al.

Informações para pedidos

Os seguintes são produtos representativos oferecidos pela Yeasen. Tamanhos adicionais estão disponíveis. Nossos produtos são altamente otimizados para trabalhar em conjunto, para ajudar a garantir desempenho e reprodutibilidade superiores. Também podemos fornecer serviços personalizados. Se você estiver interessado em um produto que não está mostrado, entre em contato conosco e trabalharemos com você para atender às suas necessidades.

Sobre a leitura:

Compartilhando o Relatório de Validação do Kit ELISA de RNA fita dupla (dsRNA) para Promover a Padronização da Detecção de dsRNA.

Referências:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymerase[J]. Progresso na pesquisa de ácido nucleico e biologia molecular, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. As mudanças estruturais da RNA polimerase T7 da iniciação da transcrição ao alongamento[J]. Opinião atual em biologia estrutural, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Classificação de gotículas ativada por fluorescência para evolução dirigida de célula única[J]. Biologia sintética ACS, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. Adições de extremidade 3′ pela RNA polimerase T7 são RNA automodeladas, distributivas e diversas em caráter — análises de RNA-Seq[J]. Pesquisa de ácidos nucléicos, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Uma RNA polimerase T7 projetada que produz mRNA livre de subprodutos imunoestimulatórios[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.