Compartilhando o relatório de validação do kit ELISA de RNA de fita dupla (dsRNA) para promover a padronização da detecção de dsRNA.

Você está procurando uma maneira confiável de detectar dsRNA residual durante a transcrição in vitro de mRNA? Não procure mais do que o Kit ELISA de RNA de fita dupla (dsRNA). No entanto, com vários kits comerciais disponíveis, é importante observar que os dados de validação podem nem sempre estar disponíveis publicamente, levando à inconsistência na detecção de dsRNA. É por isso que estamos compartilhando nosso relatório de validação do Kit ELISA de RNA de fita dupla (dsRNA), abrangendo especificidade, precisão, exatidão, sensibilidade e durabilidade. Este relatório serve como um guia de referência para validar métodos de detecção residual de dsRNA adaptados a condições experimentais específicas e padrões farmacopeicos regulatórios. Saiba mais sobre nosso relatório de validação para promover a padronização da detecção de dsRNA.

ELISA de RNA fita dupla (dsRNA) Eisto

Fundo:

O kit ELISA de RNA fita dupla (dsRNA) é um kit de reagentes projetado para detectar o dsRNA residual produzido durante o processo de transcrição in vitro do mRNA. Empregando o princípio experimental do ensaio imunoenzimático (ELISA) de sanduíche de anticorpo duplo e o sistema de amplificação biotina-estreptavidina, este kit oferece detecção sensível de dsRNA residual em amostras.

Os dados resumidos contêm parâmetros de validação que abrangem especificidade, precisão, exatidão, sensibilidade e durabilidade. O relatório atua como um guia de referência, incitando os usuários a validar métodos de detecção residual de dsRNA adaptados às suas condições experimentais específicas e aderindo aos padrões farmacopeicos regulatórios.

Materiais e métodos:

Kit: Kit ELISA de RNA fita dupla (dsRNA): Cat#36717ES (YEASEN). O kit inclui quatro tipos distintos de amostras padrão de dsRNA. Os usuários têm a opção de escolher o tipo de amostra padrão que se alinha com seu processo específico para gerar a curva padrão, evitando assim a necessidade de preparar e testar todas as amostras.

Métodos: Os materiais e etapas processuais essenciais para o experimento são predominantemente especificados pela Yeasen Biotechnology. O kit passou por testes e avaliações extensivos, garantindo que seu desempenho atenda aos requisitos estipulados do ICH Q2(R1) e da edição de 2020 da Farmacopeia Chinesa Parte Quatro "9101 Analytical Method Validation Guidelines".

Resultados

  1. Linearidade dos padrões dsRNA

Este relatório desenvolveu curvas padrão para todos os quatro tipos distintos de padrões de dsRNA, cada um com um comprimento de 300 pb. Esses padrões incluem STD1, dsRNA não modificado; STD2, dsRNA modificado por Pseudo-UTP; STD3, dsRNA modificado por N1-Me-Pseudo-UTP; e STD4, dsRNA modificado por 5-OMe-UTP. Cada tipo de padrão de dsRNA exibe excelente linearidade de diluição com R2 > 0,99 e um coeficiente de variação (CV) de concentração medida menor que 10% mostrado na Tabela 1 a Tabela 5.

Nome da DST

Tipo UTP

Linearidade da diluição (R2＞0,99)

cv

DST1

UTP

0.0156-1 pg/ μL

＜10%

DST2

pUTP

0,0156-1 pg/ μL

＜10%

DST3

N1-Me-pUTP

0,0312-1 pg/ μL

＜10%

DST4

5-OMe-UTP

0,0625-1 pg/ μL

＜10%

Tabela 1. Linearidade de diferentes padrões de dsRNA.

Concentração STD1não. (pg/μL)

Média medida (pg/μL)

Recuperação

cv

1

1.0001

100,0%

3,1%

0,5

0,4994

99,9%

2,4%

0,25

0,2516

100,7%

3,3%

0,125

0,1227

98,1%

0,5%

0,0625

0,0640

102,5%

3,2%

0,0312

0,0309

99,2%

1,3%

0,0156

0,0157

100,4%

3,2%

0

/

/

/

Tabela 2.A recuperação e o CV de STD1 diluído

Concentração STD2não. (pg/μL)

Média medida (pg/μL)

Recuperação

cv

1

1.0001

100,0%

0,7%

0,5

0,4994

99,9%

0,1%

0,25

0,2514

100,6%

0,9%

0,125

0,1232

98,6%

2,5%

0,0625

0,0635

101,6%

1,1%

0,0312

0,0312

99,9%

0,5%

0,0156

0,0155

99,6%

0,0%

0

/

/

/

Tabela 3. A recuperação e o CV de STD2 diluído

Conexão STD3. (pg/μL)

Média medida (pg/μL)

Recuperação

cv

2

2.0031

100,2%

1.6%

1

0,9880

98,8%

2,4%

0,5

0,5188

103,8%

1,2%

0,25

0,2383

95,3%

2,2%

0,125

0,1242

99,4%

0,1%

0,0625

0,0629

100,7%

1,8%

0,0312

0,0361

115,7%

1,6%

0

/

/

/

Tabela 4. A recuperação e o CV de STD3 diluído

Conexão STD4. (pg/μL)

Média medida (pg/μL)

Recuperação

cv

4

4.0096

100,2%

1,9%

2

1.9940

99,7%

0,7%

1

0,9977

99,8%

0,1%

0,5

0,5108

102.2%

0,1%

0,25

0,2454

98,2%

5,6%

0,125

0,1207

96,5%

2,8%

0,0625

0,0624

99,9%

0,3%

0

/

/

/

Tabela 5. A recuperação e o CV de STD4 diluído

  1. Especificidade

  • Análise de especificidade com dsRNA, ssRNA, dsDNA e ssDNA.
Figura 1. O kit identifica exclusivamente dsRNA e não detecta ssRNA, dsDNA ou ssDNA.

  • A especificidade não foi afetada pelo comprimento dos dsRNAs.
Figura 2. A especificidade do kit permanece consistente em dsRNAs com comprimentos diferentes (160 pb e 500 pb).

  1. UMprecisão

Adicionando 0,5 pg/μL de STD1 para uma amostra de mRNA conhecida com um conteúdo de dsRNA de 0,36 pg/μL foi conduzido em três diferentes proporções de volume (1:1, 1:20, 1:250). Em todos os casos, as taxas de recuperação de pico caíram dentro da faixa de 80-120%.

A taxa de recuperação de pico é calculada da seguinte forma: Pico Recuperação Taxa=(Medido concentração depois pico×Total volume de cravado amostra−medido concentração de o amostra×Total volume de o amostra)/(Teórico concentração de o pico×Volume de o pico)×100%

Amostras

Proporção de volume de STD1/amostra

dsRNA medido (pg/μL)

Espinho Recuperação Avaliar

Amostra (TS)

/

0,36

/

TS+0,5pg/μL DST1

1:1

0,769

81%

TS+0,5pg/μL DST1

1:20

0,777

82%

TS+0,5pg/μL DST1

1:250

0.803

82%

Tabela 6. Taxa de recuperação de pico análise

  1. Precisão

  • Precisão intra-ensaio

Os experimentos foram conduzidos em três níveis de concentração (alto, médio e baixo) para cada uma das quatro amostras padrão de dsRNA. Dentro de um único experimento, cada amostra de concentração passou por oito testes repetidos. Os resultados mostram que o coeficiente de variação (CV) está abaixo de 15% indicando uma boa precisão intra-ensaio.

DST1

Teórico concn. (pg/μL)

Réplicas

Média medida (pg/μL)

cv

1

8

1.0002

3,11%

0,125

8

0,1230

0,46%

0,0156

8

0,0164

3,18%

DST2

Teórico concn. (pg/μL)

Réplicas

Média medida (pg/μL)

cv

1

8

1.0001

0,65%

0,125

8

0,1231

2,46%

0,0156

8

0,0162

0,02%

DST3

Teórico concn. (pg/μL)

Réplicas

Média medida (pg/μL)

cv

2

8

2.0022

1,58%

0,25

8

0,2444

2,17%

0,0312

8

0,0328

1,64%

DST4

Teórico concn. (pg/μL)

Réplicas

Média medida (pg/μL)

cv

8

8

8.0803

0,27%

1

8

0,9650

0,12%

0,125

8

0,1322

2.76%

Tabela 7. Análise de precisão intra-ensaio

  • Precisão entre ensaios

Foram realizados três experimentos utilizando kits de 3 lotes. Em cada experimento, concentrações altas, médias e baixas foram escolhidas e testadas três vezes para cada uma das quatro amostras padrão de dsRNA, com oito réplicas. Consequentemente, 24 pontos de dados foram adquiridos em cada nível de concentração, que foram então utilizados para análise do coeficiente de variação (CV). Os resultados mostram que o CV para cada concentração dos padrões ficou abaixo de 15%.

DST1

Teórico concn. (pg/μL)

Testes/réplicas independentes

Média medida (pg/μL)

cv

1

3/8

1.0007

2,38%

0,125

3/8

0,1186

3,20%

0,0156

3/8

0,0173

1,27%

DST2

Teórico concn. (pg/μL)

Testes/réplicas independentes

Média medida (pg/μL)

cv

1

3/8

0,9987

0,09%

0,125

3/8

0,1269

1,06%

0,0156

3/8

0,0151

0,52%

DST3

Teórico concn. (pg/μL)

Testes/réplicas independentes

Média medida (pg/μL)

cv

2

3/8

2.0012

2,37%

0,25

3/8

0,2415

0,14%

0,0312

3/8

0,0330

1,81%

DST4

Teórico concn. (pg/μL)

Testes/réplicas independentes

Média medida (pg/μL)

cv

8

3/8

7.9735

1,89%

1

3/8

1.0225

0,13%

0,125

3/8

0.1227

5,63%

Tabela 8. Análise de precisão entre ensaios

  1. Sensibilidade

  • Nível de detalhe

O limite de detecção do conjunto é determinado pela adição de duas vezes o desvio padrão à média dos valores em branco. Medindo o OD de 24 brancos, calculando sua média e desvio padrão e, em seguida, aplicando esses valores à curva ajustada, o limite de detecção correspondente é obtido.

DO

dsRNA Padrão

Média de Blank

DP de branco

Média de Blank+2DP

Nível de detalhe

DST1

0,016

0,00048

0,01696

≤0,001pg/μL

DST2

0,016

0,00072

0,01744

≤0,001pg/μL

DST3

0,034

0,00119

0,03638

≤0,001pg/μL

DST4

0,115

0,00290

0,1208

≤0,01pg/μL

Tabela 9. Análise LOD

  • OLQ

O limite quantitativo do conjunto é estabelecido pela diluição do ponto de concentração mais baixo da curva padrão para níveis ainda mais baixos, garantindo um CV < 20% na concentração mais baixa, definindo assim o limite quantitativo. O LOQ é o seguinte.

dsRNA Padrão

OLQ

Réplicas

CV(%)

Recuperação (%)

DST1

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

DST2

0,0312 pg/μL

24

＜10%

80~120%

DST3

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

DST4

0,125 pg/μL

24

＜10%

80~120%
Tabela 10.Análise LOQ

  1. Eurabilidade

  • Anti-interferência em materiais IVT

Este teste teve como objetivo avaliar o impacto de diversas enzimas, tampões, etc., adicionados ao mRNA amostra na detecção de dsRNA pelo kit.

Adicionar concentrações específicas de T7 RNA polimerase, inibidor de RNAse, IPPA (pirofosfatase inorgânica), DNase I, VCE (enzima de encapsulamento da vacínia), 2'-O-metiltransferase (MT), tampão 1×IVT e citrato de sódio 1mM a uma amostra de mRNA fornecida e, posteriormente, utilizar STD3 tanto para a preparação da curva padrão quanto para o teste da amostra, permitiu avaliar a capacidade do kit de detectar o conteúdo de dsRNA nesses amostras. Os resultados demonstram que a presença de oito enzimas e tampões diferentes não afetou a detecção precisa de dsRNA. Além disso, as taxas de recuperação observadas caíram dentro da faixa de 80% a 120%.

Materiais IVT

dsRNA Medido (pg/μL)

Recuperação

Nenhum

0,6057

100%

T7 RNA Polimerase (15μg/mL)

0,5411

89,32%

Inibidor de RNase murina (27,5 μg/mL)

0,5142

84,88%

Pirofosfatase inorgânica (IPPA 10μg/mL)

0,7132

117,7%

DNase I (13,75 μg/mL)

0,6077

100,32%

Enzima de encapsulamento de vacínia (10μg/mL)

0,6563

108,3%

2´-O-Metiltransferase (10μg/mL)

0,5776

95,4%

1×tampão IVT

0,5003

82,6%

1 milímetro Citrato de sódio

0,6251

103,2%

Tabela 11. Recuperação de STD3 diluído adicionado com materiais IVT

  • Temperatura durabilidade

Os kits foram armazenados em ambos 4°C e 37°C para detectar as variâncias de concentração do padrão dsRNA após 7 dias. Os resultados mostram que as variâncias estão todas dentro de 20%.

dsRNA Padrão

dsRNA Medido (pg/μL) Dia 0

As variâncias após 7 dias a 4°C

DST1

1

10%

DST2

1

5%

DST3

2

7%

DST4

4

11%

dsRNA Padrão

dsRNA Medido (pg/μL)

As variâncias após 7 dias a 37°C

DST1

1

18%

DST2

1

4%

DST3

2

5%

DST4

4

8%

Tabela 12. Análise de durabilidade de temperatura


      Produto relacionado:

      Nome do produto SKU Especificações
      Kit ELISA de RNA fita dupla (dsRNA) 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNA Polimerase (RNA de baixa ds, 250 U/μL) 10628ES 10/100 KU
      T7 RNA Polimerase Grau GMP (250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

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      Referências:

      1. ICH, 2022: Validação de Método Analítico Q2, versão de rascunho.
      2. NMPA, 2007: Princípios gerais para a avaliação da validação de métodos analíticos para análise de controle de qualidade de produtos biológicos
      3. Comissão da Farmacopeia Chinesa (ChPC), 2020: Farmacopeia Chinesa, Parte Quatro: Diretrizes para a Validação de Métodos de Análise Quantitativa para Amostras Biológicas

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