Desenvolvimento da RNA polimerase T7 (baixa dsRNA) com atividades de transferase terminal mais baixa e RDRP por meio de modismos e design semi-racional.

Nos últimos anos, medicamentos baseados em mRNA têm atraído atenção significativa e foco de pesquisa. O T7 RNAP é conhecido por sua simplicidade e capacidade de catalisar a síntese de RNA com alto rendimento e fidelidade in vitro. No entanto, durante o processo de transcrição, o T7 RNAP pode produzir subprodutos como RNAs curtos abortivos, RNAs terminados prematuramente e RNAs estendidos em 3', o que cria condições favoráveis ​​para a formação de dsRNA. Portanto, reduzir a produção de dsRNA tornou-se uma necessidade urgente em aplicações práticas.

Recentemente, um estudo inovador intitulado "FADS e design semi-racional modificado T7 RNA polimerase reduziram a produção de dsRNA, com menores atividades de transferase terminal e RDRP" foi publicado online por Yeasen e Molefuture Team. Pesquisadores projetaram com sucesso o T7 RNAP para reduzir significativamente a produção de subprodutos de dsRNA durante a transcrição, reduzindo-a para 1,8% da enzima do tipo selvagem por meio de uma combinação de evolução direcionada e design semirracional.

Triagem baseada em FADS de RNAP T7

Para a triagem de RNAP T7, o FADS (Fluorescence-activated droplet sorting) foi escolhido para atender aos requisitos de alto rendimento da evolução de proteínas. Para evitar a fragmentação prematura de células, os pesquisadores usaram um chip PDMS com fases aquosas duplas, onde a lisozima foi misturada com as células no chip e exerceu sua atividade dentro das gotículas Figura 1. Os pesquisadores geraram várias bibliotecas de mutantes aleatórios com uma diversidade variando de 10⁵ para10⁶Após a triagem, 10 variantes dominantes foram identificadas e designadas como Mut1 a Mut10.  Como mostrado em Figura 2E e Figura 2F, o conteúdo de dsRNA de Mut1, Mut7 e Mut9 foi significativamente menor do que o do tipo selvagem

Figura 1. Visão geral do FADS

Figura 2. Triagem aleatória de bibliotecas e avaliação de variantes

Projeto semi-racional do T7 RNAP

Pesquisadores conduziu uma exploração de design semi-racional, criou dez bibliotecas saturadas de sítio único e empregou o método tradicional de sondas duplas baseadas em placas de microtitulação para triagem (Figura 3). A sonda de extremidade 5' adicionada é empregada para a detecção do rendimento de RNA.

Figura 3. Projeto semi-racional guiado por estrutura para diminuição de dsRNA

Após examinar mais de 1000 mutantes, os pesquisadores identificou seis candidatos: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) e Mut16 (I743L). O rendimento total de RNA de todos os seis mutantes não diferiu significativamente do tipo selvagem, indicando eficiência de transcrição geral comparável. Como esperado, o conteúdo de dsRNA de Mut11 e Mut14 foi significativamente menor em comparação ao tipo selvagem(Figura 4).

Figura 4. Triagem de microplacas e avaliação de variantes

Mut17 do embaralhamento de DNA produz menos dsRNA

Para otimizar ainda mais o T7 RNAP, foram selecionadas quatro variantes com baixo teor de dsRNA, mas que atendessem aos requisitos de produção.Os pesquisadores então construíram uma biblioteca de embaralhamento de DNA e, rastreada com placas de microtitulação, identificaram uma variante que exibia menor produção de dsRNA em comparação com seu RNAP T7 parental, denominado Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Eles subsequentemente analisaram os produtos transcricionais de Mut17 e suas variantes parentais (Mut14, Mut11 e Mut7). Conforme mostrado em Figura 5, todas as quatro variantes exibiram reduções significativas na produção de dsRNA durante a transcrição em comparação ao tipo selvagem. Notavelmente, Mut17 mostrou conteúdo de dsRNA significativamente menor de apenas 1,80% e tão baixo quanto 0,007 ng/μg no sistema de solvente de triagem.

Figura 5. Conteúdo de dsRNA do Mut17 e suas mutações parentais

A imunogenicidade do produto IVT do mutante é significativamente menor do que a do tipo selvagem.

Próximo, Avaliamos a imunogenicidade dos produtos IVT na AR murinaW264.7 células. Conforme mostrado nas Figuras 2A e 2B, os níveis de mRNA e proteína do IFN-β foram reduzidos na ARW264.7 células transfectadas com mRNA produzido por mutantes em comparação com o tipo selvagem, indicando que o mRNA sintetizado pelo RNAP T7 do tipo selvagem provocou a resposta imune mais forte, enquanto o mRNA dos mutantes mostrou uma resposta significativamente reduzida. Especificamente, o mRNA de IFN-β de células tratadas por RNA Mut11 foi de apenas 9,7% das células tratadas do tipo selvagem, e sua proteína foi de 12,93 pg/mL. Além disso, a expressão de EGFP não mostrou diferenças significativas em quantidade ou qualidade entre mRNAs gerados por diferentes RNAPs T7 (Figura 6C), atendendo aos requisitos para aplicações industriais.

Figura 6. Resposta de IFN-β e expressão de EGFP em células de mamíferos

As atividades de RDRP e transferase terminal do mutante são muito mais baixasnósr do que aqueles do tipo selvagem.

Para investigar o impacto das mutações na redução do dsRNA, os pesquisadores conduzidos estudos in silico em todas essas mutações. O resultado sugere uma indicação clara de atividade reduzida de RDRP nas variantes, pois elas mostram uma tendência diminuída de utilizar RNA como molde. Da mesma forma, isso pode ter tido um impacto na atividade da transferase terminal de T7 RNAP. Como mostrado em Figura 7, sob diferentes concentrações, todas as 4 variantes exibiram menos de 50% do valor de fluorescência em comparação ao tipo selvagem.

Subsequentemente, um ensaio de heterogeneidade de extremidade 3' foi empregado para caracterizar a atividade de transferência terminal de T7 RNAP. Ao focar na proporção de RNA com n>0, que reflete a atividade da transferase terminal, os pesquisadores descobriram que esses RNAs representavam 82,94% no tipo selvagem, enquanto os mutantes exibiam as seguintes porcentagens: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) e Mut17 (55,62%) (Figura 8). É importante ressaltar que essas porcentagens são altamente consistentes com a abundância de dsRNA nos produtos (Figura 5). Esses resultados indicam uma redução significativa na atividade da transferase terminal dos mutantes, o que, juntamente com a diminuição da atividade do RDRP, contribui para a diminuição do dsRNA.Especificamente, a atividade da transferase terminal pode desempenhar um papel mais crucial, como evidenciado pelo menor acúmulo de n>0 RNAs observado em Mut17, que também exibe a menor produção de dsRNA (Figura 5 e Figura 8).

Figura 7. Atividade relativa de RDRP

Figura 8. Heterogeneidade na extremidade 3' dos produtos de RNA

Conclusão

Este estudo fornece uma metodologia robusta para identificar mutantes com conteúdo reduzido de dsRNA e isola com sucesso múltiplos mutantes de dsRNA que têm atividade reduzida de RNA polimerase dependente de RNA e transferase terminal. Ele reforça substancialmente a validação da segurança e eficácia integrais à terapêutica de mRNA, ressaltando suas profundas implicações para o avanço de vacinas de mRNA e aplicações de terapia genética.

Ao mesmo tempo, a empresa-mãe Yeasen também lançou um produto T7 RNAP que reduz significativamente o dsRNA conteúdo. Vários parceiros já testaram os mutantes T7 RNAP modificados desenvolvidos pela Molefuture e o produto tem sido altamente reconhecido pelos clientes. Nossos clientes acreditam que o uso da nova enzima simplifica o processo de purificação do mRNA e reduz significativamente a imunogenicidade da IVT produtos, demonstra desempenho excepcional em múltiplos cenários de aplicação, comprovando seu amplo potencial de aplicação no campo biofarmacêutico!

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