I. Princípios do Western Blot
Western Blot (WB), ou imunoblotting de proteínas, é uma técnica clássica para detectar proteínas específicas com base em interações antígeno-anticorpo, amplamente utilizada em biologia molecular, imunologia e campos relacionados. Suas principais etapas incluem:
- Separação de Proteínas:
- SDS-PAGE separa proteínas desnaturadas por peso molecular.
- O SDS reveste as proteínas com uma carga negativa uniforme, eliminando influências estruturais.
- Transferência de membrana:
- As proteínas são transferidas do gel para uma membrana (por exemplo, PVDF ou nitrocelulose).
- Detecção de anticorpos:
- Os anticorpos primários se ligam especificamente à proteína alvo, seguidos por anticorpos secundários conjugados à enzima (por exemplo, HRP) que geram um sinal detectável, como a quimioluminescência.
II. Fluxo de trabalho padrão do Western Blot
| Etapa | Procedimentos Chave | Reagentes recomendados ( |
| 1. Preparação da amostra | Extrair proteínas com tampão de lise RIPA; adicionar PMSF para inibir proteases atividade. | Série de Tampões de Lise RIPA, PMSF |
| 2. Quantificação de Proteínas | Use o método BCA (Gato#20200ES) para quantificação; combine o tampão de diluição padrão com o tampão de amostra. | Kits de quantificação de BCA (Gato#20200ES/20201ES) |
| 3. Eletroforese SDS-PAGE | Use géis pré-moldados, ligue-os a 150 V até que o corante atinja o fundo do gel. | Géis pré-moldados, tampão de carga SDS-PAGE |
| 4. Transferência e bloqueio de membrana | Ativar membrana PVDF (Gato#36125ES) por imersão em metanol por 1 min; transferência a 300 mA por 60 min em banho de gelo; bloqueio em temperatura ambiente (TA) por 1 h ou uso de solução de bloqueio rápido (Gato#36122ES) por 10 min. | Transfer Buffer, Série de Membrana PVDF |
| 5. Incubação de anticorpos | Incube com o anticorpo primário a 4°C durante a noite; anticorpo secundário em temperatura ambiente por 1-2 h; lave com TBST 3x completamente. | Diluente de anticorpo |
| 6.Detecção de Proteínas | Desenvolver com ECL (Gato#36208ES). | Série de quimioluminescência ECL |
Figura 1: Fluxo de trabalho do Western Blot
III. Problemas e soluções comuns
| Emitir | Possíveis causas | Soluções |
| Alto plano de fundo  | Bloqueio incompleto | Use uma solução de bloqueio nova e aumente o tempo de bloqueio. |
| Lavagem inadequada | Aumente a frequência e a duração da lavagem para remover ligações não específicas. | |
| Concentração excessiva de anticorpos primários | Dilua o anticorpo até uma concentração apropriada. | |
| Problemas de qualidade da amostra | Verifique a pureza e a qualidade da amostra; use amostras frescas. | |
| Secagem por membrana | Garanta que a membrana permaneça hidratada durante as etapas de incubação; garanta contato total com as soluções de reação. | |
| Sinal fraco ou inexistente  | Transferência incompleta | Verifique a eficiência da transferência e ajuste o tempo conforme necessário. |
| Membrana PVDF não ativada | Mergulhe o PVDF em metanol para ativar antes de transferir para o tampão. | |
| Incompatibilidade de anticorpos primários com espécies alvo | Verifique a ficha técnica, compare as sequências de imunógenos e proteínas e inclua uma controle positivo amplamente utilizado (por exemplo, β-actina em células de mamíferos). | |
| Incompatibilidade de anticorpos primários e secundários | Garanta que o anticorpo secundário corresponda à espécie hospedeira do anticorpo primário. | |
| Ligação insuficiente de anticorpos | Aumente a concentração de anticorpos e estenda a incubação a 4°C (por exemplo, durante a noite). | |
| Baixos níveis de antígeno | Carregue pelo menos 20-30 μg de proteína por faixa; use inibidores de protease e um controle positivo. | |
| Baixa expressão de proteína alvo | Confirme a expressão na amostra por meio da literatura/banco de dados; concentre a amostra ou use um controle de alta expressão. | |
| Bandas não específicas/bandas múltiplas  | Linhas celulares com excesso de passagem alterando perfis de proteínas | Use células de baixa passagem (<15 passagens) e execute controles paralelos com estoques de passagem precoce. |
| Degradação de proteínas | Incluir inibidores de protease no tampão de lise; armazenar a -80°C, evitar congelamento e descongelamento, usar amostras frescas. | |
| Modificações pós-traducionais | Verifique a literatura para modificações que afetam o tamanho da banda (por exemplo, ubiquitinação, glicosilação). | |
| Variantes de emendas múltiplas | Verifique variantes de splicing por meio de literatura ou bancos de dados. | |
| Dímeros/multímeros de proteínas | Adicione β-mercaptoetanol fresco ou DTT ao tampão de carga SDS. | |
| Contaminação de proteínas exógenas | Verifique se há proteínas exógenas; troque as linhas celulares se necessário. | |
| Carregamento excessivo de amostra | Otimize a carga (20-30 μg) com base na expressão alvo por meio de testes de gradiente. | |
| Formação de multímeros | Ferva as amostras por 10 min para dissociar os multímeros | |
| Alta concentração de anticorpos primários | Reduza a concentração e/ou o tempo de incubação para evitar bandas extras. | |
| Alta concentração de anticorpos secundários | Reduza a concentração e inclua um controle secundário apenas para reduzir a ligação não específica. | |
| Detecção de proteínas ou membros da família não relatados | Revise a literatura ou faça o BLAST; use linhas celulares/tecidos recomendados. | |
| Se verificado, você pode ter descoberto uma nova proteína! | ||
| Bandas Sorridentes  | Migração rápida, alta temperatura do buffer, sobrecarga, buffer baixo | Migração lenta, pré-resfriamento do tampão, redução da carga de proteína, garantia de que o tampão cubra os poços completamente. |
| Bandas carrancudas  | Problemas com o dispositivo (por exemplo, bolhas sob o gel) | Ajuste a configuração para eliminar bolhas e garantir uma polimerização uniforme do gel. |
| Bandas de cauda  | Baixa solubilidade da amostra, degradação, tampão reutilizado | Misture bem as amostras, use amostras frescas e prepare um novo tampão de corrida. |
| Faixas em formato de halteres  | Gel irregular polimerização, amostras impuras | Remodele o gel para uniformidade; centrifugue as amostras antes de usar. |
| Mancha de banda  | Carga excessiva, má qualidade do gel | Reduza o volume da amostra e melhore a preparação do gel. |
| Marcas de bolhas  | Ar preso durante a transferência | Remova as bolhas ao montar o sanduíche de transferência. |
| Pontos pretos irregulares  | Solução de bloqueio não dissolvida, distribuição irregular de anticorpos | Dissolva completamente a solução de bloqueio, lave 3x com TBST e agite durante a incubação. |
| Manchas brancas  | Alta concentração de anticorpos depletando substrato | Concentrações mais baixas de anticorpos primários/secundários. |
Ⅳ.Ferramentas de seleção e otimização de produtos
Produtos relacionados:
| Procedimentos | Cat. Não. | Nome do produto | Especificações |
| Preparação da amostra | 20101ES | Tampão de lise RIPA (forte) | 100 mL |
| 20115ES | Tampão de lise RIPA (médio) | 100 mL | |
| 20114ES | Tampão de lise RIPA (fraco) | 100 mL | |
| 20118ES | Tampão de lise para ensaios WB/IP | 100 mL | |
| Kit de quantificação de proteína BCA (aprimorado) | 500 toneladas/2500 toneladas/5000 toneladas | ||
| Kit de quantificação de proteína BCA (pronto para uso) | 500 toneladas | ||
| Eletroforese SDS-PAGE | Marcador de proteína Gold Band Plus de 3 cores de alcance regular (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| Marcador de proteína de alto alcance GoldBand™ de 3 cores (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ES | Kit de preparação de gel SDS-PAGE | 1 kit (30~50 géis)/ 1 kit (150~250 géis) | |
| Kit de preparação rápida PAGE Gel | Concentrações: 8%, 10%, 12,5%, 15% | ||
| 36259ES-36280ES | Proteína pré-moldada Plus Gel | Concentrações: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% Opções de poço de carregamento: 10 poços, 12 poços, 15 poços | |
|
Transferência e bloqueio de membrana | Membrana PVDF de 0,45 μm (1 rolo, 30 cm × 3 m) | 1 rolo | |
| Membrana PVDF de 0,22 μm (1 rolo, 30 cm × 3 m) | 1 rolo | ||
| Incubação de anticorpos | 36206ES | Diluente de anticorpo primário e secundário para WB | 100 mL/500 mL |
|
Detecção de Proteínas | Reagente de detecção Super ECL | 100 mL/500 mL | |
| Kit de substrato quimioluminescente ECL aprimorado | 100 mL/500 mL |
V.Como obter suporte
Para solução de problemas personalizada ou otimização de protocolo:
- Visita:
Yeasen Página do produto Western Blot - E-mail: info@yeasenbio.com
Regra de ouro para o sucesso: Procedimentos padronizados + reagentes de alta qualidade + validação passo a passo = resultados WB reproduzíveis!
