Descrição
O T7 High Yield RNA Synthesis Kit otimiza o sistema de reação de transcrição. O kit pode sintetizar o RNA fita simples de forma eficiente usando a T7 RNA polimerase, o DNA fita dupla linear com a sequência promotora T7 como molde, NTPs como substrato para controlar a sequência de DNA a jusante do promotor. Durante a transcrição, nucleotídeos modificados podem ser adicionados ao substrato para preparar biotina ou RNA marcado com corante.
Este kit pode sintetizar transcrições longas e transcrições curtas, o RNA pode ser produzido 100-200 μg com 1 μg de entrada de molde de DNA. O RNA sintetizado pela transcrição pode ser usado para várias aplicações downstream, como pesquisa de estrutura e função de RNA, proteção de RNase, hibridização de sonda, RNAi, microinjeção e in vitro tradução.
Figura 1: In vitro Processo de transcrição de RNA
Recurso
- Até 180 μg de RNA por reação a partir de 1 μg do modelo de controle
- Sistema de reação otimizado para o processo IVT
- Diminuir a produção de dsRNA
- Maior integridade e pureza do RNA
Aplicativo
- Em vitro Síntese de RNA
Componentes
| Componentes No. | Nome | 10623ES50 (50 toneladas) | 10623ES60 (100 toneladas) | 10623ES70 (500 toneladas) |
| 10623-A | Mistura de RNA polimerase T7 | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-B | 10×Buffer de transcrição | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-C | ATP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-D | CTP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-E | GTP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-F | UTP (100 mM) | 100 μL | 200 μL | 1 mL |
| 10623-G | Modelo de DNA de controle (500ng/μL) | 10 μL | 20 μL | 100 μL |
Envio e armazenamento
Transporte de gelo seco. Armazene a -15℃ ~ -25℃, válido por dois anos.
Figuras
Figura 1. O RNA padrão foi sintetizado in vitro usando o kit de síntese de RNA T7.
A reação foi incubada em um instrumento de PCR a 37℃ por 2h e então purificada por esferas magnéticas (Cat#12602). O resultado do rendimento foi analisado pelo espectrofotômetro NanoDrop, conforme mostrado na Figura 1.
Figuras 2. Demonstração da transcrição de diferentes comprimentos de RNA pelo kit T7, respectivamente no eletroforetograma (Figuras 2A), no diagrama de eletroforese capilar (Figuras 2B) e no cromatograma (Figuras 2C)
Figura 3. Síntese de RNA encapsulado in vitro.
A reação foi incubada em instrumento de PCR a 37℃ por 2h e então purificada por esferas magnéticas (Cat#12602). O resultado do rendimento foi analisado pelo espectrofotômetro NanoDrop, conforme mostrado na Figura 3A. O resultado da integridade foi analisado por eletroforese capilar, conforme mostrado na Figura 3B.
1. Baixo rendimento de transcrição
A qualidade do template está intimamente relacionada ao rendimento. Se o rendimento do grupo experimental for significativamente menor que o do grupo de controle, as possíveis razões são:
① o modelo experimental contém componentes inibitórios;
② O modelo tem algo errado.
Sugestões:
① Repurifique o modelo;
② Determinar a quantificação do modelo e sua integridade;
③ Aumente o tempo de reação;
④ Aumentar a quantidade de entrada do modelo;
⑤ Experimente outros promotores e RNA polimerases.
2. Baixo rendimento de transcrições curtas
Um pequeno fragmento de iniciação de transcrição inibirá a reação. Quando o produto de transcrição for menor que 100 nt, estender o tempo de reação para 4-8 hs ou aumentar a quantidade de molde para 2 μg aumentará o rendimento de RNA.
3. O comprimento da transcrição do RNA é maior do que o esperado
Se a eletroforese mostrar que a banda do produto é maior que o tamanho esperado, as possíveis razões:
①O modelo do plasmídeo pode não ser completamente linearizado;
②A extremidade 3' da fita sentido tem uma estrutura proeminente;
③O RNA tem uma estrutura secundária que não é completamente desnaturada.
Sugestões:
①Verifique se o modelo está completamente linearizado e, se necessário, execute linearização adicional;
②Selecione uma enzima de restrição adequada para evitar saliências 3' ou use o Fragmento Klenow/DNA polimerase T4 para completar a transcrição antes de prosseguir;
③Use gel desnaturado para detectar produtos de RNA.
4. O comprimento da transcrição do RNA é menor do que o esperado
Se a eletroforese mostrar que a banda do produto é menor que o tamanho esperado, as possíveis razões:
①O modelo contém uma sequência de terminação semelhante à RNA polimerase T7;
②O conteúdo GC no modelo é alto.
Sugestões:
①Abaixe a temperatura da reação (por exemplo, 30°C). Às vezes, abaixar a temperatura pode aumentar o comprimento da transcrição, mas reduzirá o rendimento. Ou tente diferentes RNA polimerases para transcrição;
②Se o conteúdo do GC do modelo for alto, use 42℃ para transcrever ou adicionar SSB para aumentar o rendimento e o comprimento da transcrição.
5. Cauda de eletroforese de produtos de transcrição
Há um fenômeno de cauda durante a eletroforese.
Possíveis razões:
①Contaminado por RNase durante operação experimental;
②Modelo de DNA contaminado por RNase.
Sugestões:
①Use pontas de pipeta e tubos EP livres de RNase, use luvas e máscaras de látex descartáveis e todos os reagentes são preparados com H2O livre de RNase.
②Repurifique o DNA modelo.
[1] Dong Z, Zheng N, Hu C, et al.Nosema bombycis microRNA-like RNA 8 (Nb-milR8) aumenta a patogenicidade fúngica ao modular a expressão do gene BmPEX16 em seu hospedeiro, Bombyx mori. Microbiol Spectr. 2021;9(2):e0104821. doi:10.1128/Spectrum.01048-21(IF:7.171)
[2] Wang X, Tang S, Ye S, et al. Quantificação ultrassensível de miR-195-5p circulante com cascata de amplificação de deslocamento de fita tripla. Talanta. 2022;242:123300. doi:10.1016/j.talanta.2022.123300(IF:6.057)
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Investigação
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