Hieff^™ Célula rápida direta O kit RT-qPCR baseado no corante SYBR Green é adequado para extração de RNA de todos os tipos de células animais (como células de parede de linhagem celular e células de suspensão, células de cultura primária, várias células-tronco, células iPS, etc.), sem a necessidade de extrair RNA, e pode ser usado diretamente para análise de expressão de qPCR, que é curta, fácil de operar e tem uma baixa taxa de erro. Leva apenas 1,5 horas para concluir as etapas da preparação do modelo até a reação de transcrição reversa e análise de expressão gênica.

Reagentes de transcrição reversa e detecção de fluorescência estão incluídos no kit, que podem ser usados ​​para análise de expressão genética sem a necessidade de comprar reagentes adicionais.

Especificações

Componentes

Armazenar

O tampão de lise FCD e o tampão de lavagem FCD foram derretidos e armazenados a 4°C para evitar contaminação. Solução de parada FCD, DNase I, 4× Hifair™ FCD RT Mix, 2× Hieff™ FCD qPCR SYBR Master Mix devem ser armazenados a -25~-15℃.

Instruções

1. Preparação de produtos de clivagem

1)1. Derreta o reagente em temperatura ambiente, vire-o de cabeça para baixo e misture delicadamente antes de usar, e use-o após leve centrifugação para evitar formação de espuma*.

*A falha na mistura dos reagentes, o uso de um oscilador para mistura e a falha na configuração dos reagentes no gelo podem levar a uma diminuição no desempenho da reação.

2)Dependendo do tipo de célula**, transfira as células para um tubo de centrífuga e centrifugue a 5000 rpm por 2 min para coletar as células e aspirar bem o meio. Se as células forem cultivadas em placas de 96 poços, o meio pode ser aspirado diretamente.

​​​​​​​​3) Adicione 150 μL de tampão de lavagem FCD a cada poço, lave as células soprando, centrifugue a 5000 rpm por 2 min e aspire o tampão de lavagem FCD***.

​​​​​​​​4) Adicione 48 μL de solução tampão de lise FCD e 2 μL de solução DNase I a cada poço, sopre e misture em temperatura ambiente, deixe repousar por 5 minutos e adicione 2.5 μL de solução de parada FCD após a incubação**** e, em seguida, sopre e misture por cerca de 5 vezes para obter o produto de clivagem*****.

** O requisito básico para o número de células é 1 × 10⁴ células por poço, e este kit pode ser usado na faixa de 1 × 10³ - 1 × 10⁶ células. Se o número de células for maior, a quantidade de solução de tampão de lise FCD e solução de DNaseⅠ pode ser aumentada proporcionalmente, conforme apropriado.

*** As condições de centrifugação variam de célula para célula, portanto, centrifugue a uma velocidade apropriada para as células que estão sendo usadas.

**** Adicione 2,5 μL de solução de parada FCD a 50 μL de lisado e aumente a quantidade de solução de parada FCD conforme necessário.

***** Para armazenamento de longo prazo de soluções de produtos de lise celular, coloque a -20°C.

5）Derreta 4 x Hifair™ FCD RT Mix em temperatura ambiente e misture com leve inversão, coloque no gelo e configure o sistema de reação de acordo com a tabela abaixo:

*******O nível de uso recomendado é de 2-5 μL, tente não exceder 45%.

1. Transcrição reversa

Pipete e misture delicadamente a solução de reação preparada acima e realize a reação de transcrição reversa de acordo com o procedimento na tabela abaixo:

* A temperatura de transcrição reversa recomendada é de 55°C. Para modelos de alto conteúdo de GC ou modelos complexos, a temperatura de transcrição reversa pode ser aumentada para 60°C. O produto de transcrição reversa pode ser usado diretamente para detecção de RT-qPCR downstream. Para evitar a inibição da reação de qPCR pelo sistema de transcrição reversa e obter o valor Ct apropriado (10-35), o produto pode ser diluído de 10 a 1000 vezes e então usado. Se os experimentos downstream não forem realizados por um curto período, pode ser colocado a -20℃ para armazenamento.

1. PCR quantitativa de fluorescência

1）Reação sistema configuração

As seguintes proporções são recomendadas para a preparação da solução de reação (preparação em gelo).

*Não adicione mais de 1/10 do volume de RT-qPCR do produto de transcrição reversa. A alta concentração do modelo levará facilmente à amplificação não específica, diluição apropriada de 5-50 vezes. A quantidade recomendada de modelo é de 4 μL, tente não exceder 6 μL. Quando o desempenho da reação for ruim, a concentração do primer pode ser ajustada na faixa de 0,2-1,0 μmol/L.

2）Procedimento de amplificação quantitativa por PCR de fluorescência (método de duas etapas)

3）Procedimento de amplificação rápida para PCR quantitativa fluorescente (método de duas etapas)

* A temperatura de anelamento/extensão e o tempo de extensão final podem ser ajustados apropriadamente de acordo com os requisitos experimentais. O programa rápido é adequado para a maioria dos genes, e o programa padrão pode ser tentado para genes individuais de estrutura secundária complexa.

Notas

1. Este produto é somente para uso em pesquisa.
2. Por favor, opere com jalecos e luvas descartáveis, para sua segurança.

Ver.EN20230908

Documentos:

Manuais

11172-Hieff™ Fast Cell Direto. EN20230908.pdf