O Hieff Superfast DNA Methylation Bisulfite Kit (baseado em coluna) converte rapidamente citosinas não metiladas em amostras de DNA em uracila, enquanto deixa as citosinas metiladas inalteradas. Durante o tratamento com bissulfito em alta temperatura, o DNA fita dupla desnatura em fitas simples. Na presença de HSO3-, os resíduos de citosina sofrem desaminação e são convertidos em uracila, com as citosinas metiladas permanecendo inalteradas. Na amplificação por PCR subsequente, o uracila é substituído por timina (T). O processo de conversão leva apenas 5 minutos, acomodando entrada de DNA variando de 100 pg a 2 μg, e atinge uma eficiência de conversão de ≥99% para citosinas não metiladas. O DNA convertido é adequado para aplicações posteriores, como amplificação por PCR e sequenciamento NGS.

Recurso

Baixa entrada: Adequado para converter amostras variando de 100 pg a 2 μg

Tempo de conversão curto: aproximadamente 5 minutos.

Danos mínimos na amostra: Manter boa integridade da amostra após a conversão.

Alta eficiência de conversão: Taxa de conversão ≥99%, altas taxas de conversão em regiões com alto GC e baixa taxa de falsos positivos.

Adequado para amostras raras, como a conversão de metilação de DNA de célula única.

Capaz de conversão de metilação de amostras de RNA.

Produto Componentes

Observação:

Para 10 testes por caixa: Adicione 4,4 mL de etanol anidro à solução de lavagem.

Para 50 testes por caixa: Adicione 22 mL de etanol anidro à solução de lavagem.

Após adicionar o etanol anidro, inverta e misture bem, então armazene para uso futuro. Certifique-se de que a tampa do frasco esteja bem fechada para evitar a evaporação do etanol, o que pode afetar o desempenho do reagente.

Figura

Figura 4. A conversão de bissulfito em amostras de DNA genômico humano foi realizada usando os kits de conversão 12225 e Q do concorrente. Posteriormente, kits de preparação de biblioteca de DNA fita simples específicos para metilação foram utilizados para gerar bibliotecas. Os dados de rendimento da biblioteca e controle de qualidade são apresentados acima. Os resultados demonstram que, ao sequenciar as bibliotecas agrupadas dos kits 12225 e Q do concorrente, o kit 12225 produziu maior saída de dados, atingiu uma maior taxa de alvo (%) e exibiu menores taxas de duplicação (%).

Envio e armazenamento

Armazene a solução de conversão 12225-A em temperatura ambiente, protegida da luz. Armazene outros componentes em temperatura ambiente. O prazo de validade é de 12 meses.

Observação:

1. Para garantir o sucesso dos experimentos downstream, quantifique com precisão a quantidade total de DNA de entrada durante a etapa de conversão. É recomendado usar o Qubit 3.0/4.0 para quantificação de DNA, com uma razão A260/A280 entre 1,7 e 1,9. O intervalo de DNA de entrada deve estar entre 100 pg e 2 μg, com um intervalo ideal de 100 ng a 1 μg. A entrada insuficiente de DNA pode dificultar a detecção downstream, enquanto a entrada excessiva pode reduzir a eficiência de recuperação e conversão.

2. A solução de conversão, solução de dessulfonação e solução de lavagem contêm componentes voláteis. Após o uso, aperte imediatamente as tampas e armazene em temperatura ambiente.

3. Para amostras pós-conversão, prossiga com experimentos posteriores imediatamente. Para armazenamento de curto prazo, mantenha a -20°C, e para armazenamento de longo prazo, mantenha a -80°C.

4. Para sua segurança e saúde, use jaleco e luvas descartáveis ​​durante a operação.

5. Este produto é somente para uso em pesquisa!

Instruções

Preparação de reagentes e consumíveis: Tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL, água sem enzimas, etanol absoluto, tubo de PCR;

eu Conversão de bissulfito:

1) Prepare o tubo de PCR estéril correspondente de acordo com o número de amostras a serem testadas e prepare o sistema de reação de acordo com a tabela a seguir:

2) Sistema de transformação

Use uma pipeta para soprar e misturar o sistema acima ou agite em vórtice e misture por 5 s, depois centrifugue por um curto período e centrifugue a solução de reação para o fundo do tubo de PCR.

você Nota: 1. Neste momento, o volume total da solução de reação no tubo de PCR é de 200 μL. Para tornar a transformação mais completa, a solução de reação deve ser dividida em partes iguais e transferida para um novo tubo de PCR estéril após soprar e misturar na etapa 2), e o procedimento de transformação deve ser executado. Após a conversão, as soluções de reação nos dois tubos de PCR foram combinadas na mesma coluna de purificação para purificação.

2. Se o volume da amostra estiver entre 20 e 40 μL, reduza o volume da solução de transformação para manter um volume total de 200 μL.

3. Se o volume da amostra for 50 μL, 150 μL da solução de transformação são adicionados, o volume total é mantido em 200 μL e o tempo de transformação é estendido para 6-10 min.

3) Configuração do programa de conversão de TC

O tubo de PCR é colocado em um instrumento de PCR com um programa predefinido para realizar a reação.

eu Purificação

1) Etransferir 200 μL do conversão solução para o Pcoluna de urificaçãoe, centrifugar por 30-60 s 13000 g, descarte o filtrado e coloque a coluna de purificação no Ctubo de coletae de novo;

2) Adicione 100 μL de Tampão de lavagem em Colunas de purificação (confirmar que foi adicionado etanol absoluto), centrifugar por 30-60 s 13000 g, descarte o filtrado e coloque a coluna de purificação no Ctubo de coletae de novo;

3) Adicione 200 μL de Tampão de dessulfonação para dentro do Colunas de purificação , e deixar a reação em temperatura ambiente por 20 min. Após a reação, centrifugar por 30-60 s 13000 g, descarte o filtrado e coloque o Colunas de purificação no Ctubo de coletae de novo;

4) Adicione 200 μL de Tampão de lavagem para o Colunas de purificação, centrifugar por 30-60 s 13000 g descarte o filtrado e coloque o Pcoluna de urificaçãoe no Ctubo de coletae de novo;

5) Repita o passo 4) uma vez;

6) Transferir o Colunas de purificação ao tubo de centrífuga de 1,5 mL preparado, adicione 10-30 μL de Tampão de eluição para o centro da membrana do filtro após a abertura da tampa e secagem, e coletar o ADN após permanecer por 1 min em temperatura ambiente e centrifugar por 1 min a 13000 g;

7) Armazene o ADN temporariamente a -20 ℃. Para armazenamento de longo prazo, armazene o ADN a -80 ℃ e evite congelamentos e descongelamentos desnecessários e repetidos.

Nota: O produto de transformação purificado pode ser usado diretamente na reação de PCR subsequente ou no processo de sequenciamento.

Manual