Hieff NGS™ One Pot Flash DNA Library PrepKit é um kit de biblioteca de DNA enzimático rápido，bruxa contém enzima de alta qualidade para fragmentação de DNA e combina fragmentação de DNA, reparo final e dA-tailing em uma única etapa, o que reduz significativamente o tempo e o custo da preparação da biblioteca.

Este kit de preparação de biblioteca é compatível com amostras de 100 pg-500 ng de todos os animais, plantas, microrganismos comuns, etc.

e realizar rapidamente a fragmentação do DNA, o reparo terminal e a reação de adição da cauda A em um único tubo. O kit precisa ser combinado com adaptadores e primers e é compatível com Illumina e MGI plataformas de sequenciamento de alto rendimento.

Recurso

1) Adequado para amostras de DNA genômico de 100 pg-500 ng.

2）compatível com Illumina e MGI plataformas de sequenciamento de alto rendimento.

3）Fragmentação, reparação final e cauda A reação dentro 5 minutos.

4）Taxa de conversão de biblioteca eficiente e eficiência de amplificação.

Especificações

Componentes

Observação: * indica que este reagente não está incluído neste kit e são necessários reagentes adicionais.O kit é compatível com plataformas duplas de Illumina e MGI, mas mistura de primer adicional (CAT # 13334 Primer Mix para MGI e Cat# 13335 Primer Mix para Illumina) é necessário.

Armazenar

Este produto deve ser armazenado a -25~-15°C para 1 ano.

Figuras

Figura 1. Detecção de DNA de 10 tipos de microrganismos

As bibliotecas foram preparadas usando Gato#12316 protocolo ,10 ng o Padrão de DNA da Comunidade Microbiana ZymoBIOMICS (Zymo Research® #D6306). As bibliotecas foram reunidas e sequenciadas em um Illumina (SE75).Os dados de sequenciamento foram homogeneizados para 20M e comparados entre a composição esperada e detectada para ambos os níveis de entrada. A detecção de gDNA microbiano específico foi consistente com a composição esperada. Composição esperada: Cryptococcus neoformans 2%, Saccharomyces cerevisiae 2%, Bacillus subtilis 12%, Escherichia coli 12%, Enterococcus faecalis 12%, Lactobacillus fermentum 12%, Listeria monocytogenes 12%, Pseudomonas aeruginosa 12%, Staphylococcus aureus 12% e Salmonella enterica 12%.

Sobre a operação

1. Por favor, opere com jalecos e luvas descartáveis，para sua segurança.

2. Descongele os componentes em temperatura ambiente. Após o descongelamento, misture bem no vórtex, gire o tubo brevemente e coloque-o no gelo para uso posterior.

3. Ao preparar a solução de reação em cada etapa, é recomendado usar uma pipeta para soprar e misturar uniformemente ou agitar suavemente. Agitação violenta pode fazer com que a saída da biblioteca diminua.

4. Para evitar contaminação cruzada de amostras, é recomendado usar uma cabeça de pistola com um elemento de filtro. Por favor, substitua a cabeça de pistola ao absorver amostras diferentes.

5. É recomendado executar cada etapa da reação em um termociclador com tampa aquecida. O termociclador deve ser pré-aquecido à temperatura definida antes do uso.

6. Operações impróprias podem muito provavelmente causar contaminações por aerossol, impactando a precisão do resultado. O isolamento físico obrigatório das regiões de mistura de reação de PCR e regiões de ensaio de purificação de produto de PCR é recomendado. Equipado com equipamentos como pipetas especializadas para construção de biblioteca.

7. Este produto é somente para uso em pesquisa.

Sobre a fragmentação do DNA

1. O alcance compatível deste kit é de 100 pg–500 ng de DNA de entrada. DNA de entrada de alta qualidade com A260/A280 = 1,8-2,0 deve ser usado o máximo possível.

2. Se o DNA de entrada contiver alta concentração de agente quelante de íons metálicos ou outros sais, isso pode afetar os experimentos subsequentes. É recomendado diluir o DNA em ddH2O ou Tebuffer (10 mm tris-HCl, pH 8,0-8,5; 0,1 mM EDTA).

3. Para a maioria do DNA genômico de alta qualidade, o tempo de digestão é mostrado na Tabela 1. O kit tem baixa preferência e pode tolerar vários modelos com conteúdo de GC.

Tabela 1. Tempo recomendado de fragmentação convencional do DNA genômico

Ligação do adaptador

1. A concentração do adaptador afeta diretamente a eficiência da ligação e o rendimento da biblioteca. O uso excessivo do adaptador pode produzir mais adaptadordímero; A baixa dosagem pode afetar a ligadura eficiência e rendimento da biblioteca. As tabelas 2 e 3 listam a quantidade recomendada de Adaptador para diferentes entradas de DNA usando este kit.

Tabela 2. O Illumina recomendado quantidade de adaptador para diferentes DNA de entrada

Tabela 3. O MGI recomendado quantidade de adaptador para diferentes DNA de entrada

Amplificação de biblioteca

Os números do ciclo de amplificação devem ser rigorosamente controlados. A amplificação insuficiente pode levar a um baixo rendimento da biblioteca; A superamplificação pode introduzir viés aumentado, erros, leitura duplicada e produtos quiméricos. Tabela 4 lista os números de ciclos recomendados visando o rendimento da biblioteca de 1 µe.

Tabela 4. Os ciclos recomendados de 100 pg-500 ng DNA de entrada

Limpeza de DNA baseada em esferas e seleção de tamanho

1. Existem várias etapas no processo de construção da biblioteca que exigem esferas magnéticas de purificação de DNA. Recomendamos Hieff NGS™ Contas de seleção de DNA (Yeasen Cat#12601) ou AMPure™ Esferas magnéticas XP (Beckman Cat#A63880) para purificação de DNA e seleção de tamanho.

2. As esferas magnéticas devem ser equilibradas em temperatura ambiente antes do uso, caso contrário o rendimento diminuirá e o efeito de seleção do tamanho será afetado.

3. As esferas magnéticas devem ser bem misturadas por vórtice ou pipetagem antes do uso.

4. Não aspire as esferas ao transferir o sobrenadante, mesmo pequenas quantidades das esferas podem afetar as reações seguintes.

5. O etanol 80% deve ser preparado recentemente, caso contrário afetará a eficiência da recuperação.

6. As esferas magnéticas devem ser secas à temperatura ambiente antes da eluição do produto. Secagem insuficiente facilmente fará com que o resíduo de etanol afete as reações subsequentes; secagem excessiva fará com que as esferas magnéticas quebrem e reduzam o rendimento da purificação. Normalmente, a secagem à temperatura ambiente por 3-5 minutos é suficiente para permitir que as esferas sequem completamente.

7. Se necessário, as amostras de DNA purificadas ou selecionadas por tamanho são eluídas em 0,1× O tampão TE pode ser armazenado a 4°C por 1-2 semanas ou a -20°C por um mês.

Análise de qualidade da biblioteca

1. A qualidade das bibliotecas construídas é geralmente analisada pela medição das concentrações e distribuições de tamanho.

2. As concentrações das bibliotecas podem ser medidas por métodos baseados em fluorescência, como Qubit e PicoGreen ou qPCR.

3. Não é recomendado usar métodos de quantificação baseados em absorbância, como o NanoDrop.

4. É recomendado usar o método qPCR para quantificação de biblioteca: métodos baseados em fluorescência como Qubit e PicoGreen não conseguem diferenciar as estruturas de dsDNA incompletas (inserções sem adaptador ou com apenas uma das extremidades ligadas com adaptador) das bibliotecas completas. O método qPCR amplificará e medirá apenas as bibliotecas completas com ambas as extremidades ligadas com adaptadores (as bibliotecas sequenciáveis), fornecendo assim uma medição mais precisa para carregamento.

5. A distribuição de tamanho das bibliotecas pode ser analisada usando o Agilent Bioanalyzer ou outros dispositivos baseados nos princípios de eletroforese capilar ou microfluídica.

Documentos:

Ficha de dados de segurança

12316_MSDS_HB250211_PT.PDF

Manuais

12316_Manual_Ver.ENão20241225.pdf