Hieff NGS^TM O kit de preparação de biblioteca de RNA EvoMax (dUTP) é um pré-misturado, actinomicina D livre e específico do fio total Biblioteca de sequenciamento de RNA preparação kit compatível com as plataformas Illumina e MGI. Este produto está disponível em dois tipos: tubo ou kit de vedação, e esse kit é mais conveniente seja por dispositivo automatizado de manuseio de líquidos ou manipulação manual . O kit contém reagentes de fragmentação de RNA, reagentes de transcrição reversa, reagentes de síntese de ds-cDNA específicos de fita e reagentes de amplificação de biblioteca. Pode ser vinculado ao kit de purificação de mRNA ou ao kit de remoção de rRNA para faça pesquisa de mRNA ou lncRNA. Este produto otimiza o módulo de transcrição reversa para obter uma biblioteca de alta especificidade de cadeia sem actinomicina D, o que garante a segurança dos experimentadores em maior extensão. Todos os reagentes foram submetidos a rigoroso controle de qualidade e validação funcional para maximizar a estabilidade e repetibilidade da biblioteca preparação.

Especificações

Componentes

Nota: * A notação indica que o componente não está incluído no kit. A mistura de primer é necessária se os adaptadores completos forem usados, caso contrário, não é't. Este kit é compatível com as plataformas Illumina e MGI, mas precisa de mistura de primer adicional (Cat # 13334 Primer Mix para MGI^TM e Cat # 13335 Primer Mix para Illumina®) para plataforma Illumina® ou MGI se os adaptadores completos forem usados.

Figura

Layout do grupo de reagentes da placa.

Figura 1: Layout de reagentes do kit de biblioteca de placas de vedação

Figura 2. Componentes simplificados de Kit de preparação de biblioteca de RNA EvoMax.

Armazenar

Este produto deve ser armazenado a -25~-15℃ por 1 anos.

Instruções

1. A quantidade recomendada para adicionar em um sistema de 20 μL é 0,1-1 unidades (U), e a quantidade de entrada pode ser ajustada com base nos resultados reais.

2. De acordo com as demandas do experimento, a concentração final de dUTP pode ser ajustada entre 0,2~0,6 mM, e 0,2 mM de dTTP pode ser adicionado seletivamente.

3. Tempo de reação a 25~37℃ pode ser ajustado dentro de 5 a 10 minutos de acordo com a necessidade experimental.

Notas

1. Operação

1) Por favor, opere com jalecos e luvas descartáveis，para sua segurança.

2) Descongele os componentes em temperatura ambiente. Misture bem invertendo para cima e para baixo várias vezes, gire para baixo brevemente e coloque no gelo para uso.

3) É recomendado executar cada reação de etapa em um termociclador com tampa aquecida. O termociclador deve ser pré-aquecido à temperatura definida antes do uso.

4) Suprimentos livres de contaminação por RNase e limpeza regular da área experimental são necessários. RNAZap da ThermoFisher^TM Foi recomendado spray de remoção de ácido nucleico de alta eficiência para remover a contaminação por RNase.

5) Operações impróprias podem muito provavelmente causar contaminações por aerossol, impactando a precisão do resultado. O isolamento físico obrigatório das regiões de mistura de reação de PCR e regiões de ensaio de purificação de produto de PCR é recomendado. Equipado com equipamentos como pipetas especializadas para construção de bibliotecas.

6) Este reagente é para uso único. O uso múltiplo é estritamente proibido.

7) Este produto é somente para uso em pesquisa.

2. Ligação do adaptador

1) Os kits de adaptador longo (adaptador com código de barras) e kits de adaptador curto da Illumina ou MGI estão disponíveis para os clientes escolherem de acordo com suas necessidades experimentais.

2) Foi recomendado selecionar adaptadores comerciais de alta qualidade. Se forem selecionados adaptadores feitos por você mesmo, confie a uma empresa com experiência em síntese de primers NGS e observe a necessidade de controle rigoroso de contaminação. Além disso, é recomendado preparar a solução de recozimento de DNA em uma bancada limpa e operar apenas um tipo de adaptador por vez para evitar contaminação cruzada.

3) Descongele os adaptadores no gelo ou a 4 °C; ao operar em temperatura ambiente, a temperatura do laboratório não deve exceder 25 °C para evitar que os adaptadores desnaturem.

4) A concentração do adaptador afeta diretamente a eficiência da ligação e o rendimento da biblioteca. O volume do adaptador adicionado ao kit é fixado em 5 μl. Recomenda-se que os adaptadores sejam diluídos com tampão 0,1×TE e os adaptadores diluídos podem ser armazenados a 4°C por 48 horas. Tabela 1 lista a quantidade de adaptador recomendada para diferentes quantidades de RNA de entrada.

Tabela 1-1 Quantidade recomendada de adaptador Illumina para diferentes RNAs de entrada

Tabela 1-2 Quantidade recomendada de adaptador MGI para diferentes RNA de entrada

* O uso do adaptador pode ser ajustado de acordo com diferentes tipos de amostras de RNA total e quantidade de entrada

3.Amplificação de biblioteca

1) Com base na DNA polimerase de primeira geração, a DNA polimerase de alta fidelidade no kit melhorou muito sua uniformidade de amplificação e não apresenta viés de amplificação.

2) Os números do ciclo de amplificação devem ser rigorosamente controlados. A amplificação insuficiente pode levar a um baixo rendimento da biblioteca; A superamplificação pode introduzir viés aumentado, erros, leitura duplicada, produtos quiméricos e acúmulo de mutações de expansão. A Tabela 2 lista os números de ciclos recomendados para amplificação por PCR.

3) O número recomendado de ciclos recomendado na Tabela 2 pode atender à grande maioria dos requisitos de preparação da biblioteca. Se sua amostra for de baixa qualidade (como amostras FFPE com degradação severa), o número de ciclos pode ser aumentado apropriadamente, de acordo com a situação real. Preste atenção para observar que o mRNA varia de diferentes espécies e tecidos, o número de ciclos de amplificação deve ser ajustado.

Tabela 2 Volume total de RNA de entrada e ciclos de amplificação recomendados Tabela *

[Nota]: *O rendimento da biblioteca não está relacionado apenas à quantidade de entrada e ao número de ciclos de amplificação, mas também é afetado pela qualidade das amostras, condições de fragmentação e condições de classificação. No processo de construção da biblioteca, escolha as condições mais apropriadas de acordo com a situação real.

4. Limpeza de DNA baseada em esferas e seleção de tamanho

1) Existem várias etapas no processo de construção da biblioteca que exigem esferas magnéticas de purificação de DNA. Recomendamos as esferas de seleção de DNA Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) ou esferas magnéticas AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) para purificação de DNA e seleção de tamanho.

2) A esfera magnética deve ser equilibrada à temperatura ambiente antes do uso, caso contrário o rendimento diminuirá e o efeito de seleção do tamanho será afetado.

3) As esferas magnéticas devem ser bem misturadas por vórtice ou pipetagem antes do uso.

4) Não aspire as esferas ao transferir o sobrenadante, mesmo pequenas quantidades das esferas podem afetar as reações seguintes.

5) O etanol 80% deve ser preparado recentemente, caso contrário afetará a eficiência da recuperação.

6) As esferas magnéticas devem ser secas à temperatura ambiente antes da eluição do produto. Secagem insuficiente facilmente fará com que o resíduo de etanol afete as reações subsequentes; secagem excessiva fará com que as esferas magnéticas quebrem e reduzam o rendimento da purificação. Normalmente, a secagem à temperatura ambiente por 3-5 minutos é suficiente para permitir que as esferas sequem completamente.

7) Se necessário, as amostras de DNA purificadas ou selecionadas por tamanho eluídas em tampão TE podem ser armazenadas a 4 °C por 1-2 semanas ou a -20 °C por um mês.

5.Análise de qualidade da biblioteca

Geralmente, a qualidade da biblioteca construída pode ser avaliada pela detecção de concentração e detecção de distribuição de comprimento.

6. Outros materiais

1) Kit de enriquecimento de mRNA: Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).

2) Kit de remoção de rRNA: Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS / ETS) (Yeasen Cat # 12257) ou outro kit de remoção de rRNA.

3) Purificação de RNA de esferas magnéticas: Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat # 12602) ou outros produtos equivalentes.

4) Esferas magnéticas de DNA purificado: Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat # 12601) ou AMPure® XP Beads (A63880) ou outros produtos equivalentes.

5) Controle de qualidade do RNA: Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip ou outros produtos equivalentes.

6) Adaptadores: Adaptador completo para uso Illumina® (Cat # 13519-13520 ou outro equivalente) ou Adaptador completo para uso MGI® (Cat # 13360-13362 ou outro equivalente).

7. Inspeção de qualidade da biblioteca

Chip Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 / Chip de alta sensibilidade ou outros produtos equivalentes; reagentes de quantificação de biblioteca.

8. Outros materiais

Etanol anidro, água ultrapura estéril, cabeçote de pistola de baixa adsorção, tubo de PCR, estrutura magnética, instrumento de PCR, etc.

Fluxograma

Figura 1: Processo de construção da biblioteca de RNA

Preparação da biblioteca de RNA para amostras FFPE de diferentes qualidades

Para RNA FFPE severamente degradado (DV 200 <50%) e amostras de baixa entrada, recomendamos um protocolo de purificação dupla após a ligação do adaptador para reduzir a perda da biblioteca.

Padrões de pico de amostras FFPE de diferentes qualidades