Descrição do produto

O Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit é um kit de esferas magnéticas especialmente para purificação de mRNA. As esferas de captura de mRNA são microesferas paramagnéticas de tamanho micrométrico acopladas com caudas Oligo dT (poli A), que podem ser usadas para isolar mRNA de 10 ng a 4 μg de RNA completo ligando-se ao mRNA com caudas poli A.

Especificações

Componentes

Armazenar

O produto deve ser armazenado entre 2 ~ 8℃ por um ano e evitado o congelamento.

Instruções

1. Materiais necessários não incluídos

Suporte magnético, tubos de PCR sem nuclease

2. Operação

1) Equilibrar as esferas de captura de mRNA em temperatura ambiente (~ 30 min).

2) Diluir 10 ng – 4 μg de RNA total para 50 μL com água sem nuclease em um tubo de PCR sem nuclease e colocá-lo no gelo.

3) Misture as esferas magnéticas invertendo-as de cabeça para baixo ou agitando em vórtice. Adicione 50 μL das esferas magnéticas em 50 μL da amostra total de RNA e pipete 6 vezes para misturar bem. Gire brevemente para baixo até o fundo do tubo.

4) Incube a mistura de esferas magnéticas e RNA em um termociclador e execute o seguinte programa: 65°C, 5 min; 25°C, 5 min; 25°C, manter.

5) Coloque o tubo sobre um suporte magnético prateleira por 5 minutos para separar o mRNA do RNA total. Remova cuidadosamente o sobrenadante.

6) Retire o tubo do magnético prateleira e ressuspenda as esferas magnéticas com 200 μL de tampão de lavagem de esferas. Pipete todo o volume para cima e para baixo 6 vezes para misturar completamente. Coloque o tubo em um tubo magnético prateleira por 5 min e remova cuidadosamente o sobrenadante.

7) Repita o passo 6.

8) Retire o tubo do magnético prateleira. Adicione 50 μL de tampão Tris para ressuspender as esferas magnéticas e pipete 6 vezes para misturar bem.

9) Coloque a amostra em um termociclador e execute o seguinte programa para eluir o mRNA: 80°C, 2 min; 25°C, manter.

10) Remova a amostra do termociclador. Adicione 50μL de Beads Binding Buffer e pipete repetidamente 6 vezes para misturar completamente.

11) Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir que o mRNA se ligue às esferas magnéticas.

12) Coloque o tubo no magnético deixe repousar por 5 minutos e remova cuidadosamente o sobrenadante.

[Nota]: Uma pipeta de 10 μL é necessária para aspirar o líquido restante.

13) Retire o tubo do magnético prateleira, ressuspenda as esferas magnéticas com 200 μL de tampão de lavagem de esferas, pipete repetidamente 6 vezes para misturar completamente. Coloque o tubo no magnético prateleira em temperatura ambiente por 5 minutos. Remova e descarte todo o sobrenadante.

14) eluição final do mRNA

Esquema A: Para reação de transcrição de reserva

Remova o tubo do magnético prateleira. Adicione 12μL de água sem nuclease e pipete repetidamente 6 vezes para misturar bem. Coloque o tubo no termociclador e execute o seguinte programa: 80°C, 2 min. Em seguida, coloque o tubo no magnético prateleira imediatamente, deixe em temperatura ambiente por 5 min. Após a solução ser clarificada, aspire cuidadosamente 10 μL do sobrenadante para outro novo tubo de PCR livre de nuclease.

Esquema B: Para RNA preparação da biblioteca

Adicione o volume apropriado de Frag/Primer Buffer de acordo com as instruções do kit relevante para a construção da biblioteca.

Observação

1. Para sua segurança e saúde, use jalecos e luvas descartáveis ​​durante a operação.
2. Somente para uso em pesquisa.
3. Certifique-se de aquecer até a temperatura ambiente e misturar bem antes de usar as esferas magnéticas, caso contrário, a eficiência de recuperação das amostras pode ser afetada.
4. A operação deve ser estritamente livre de contaminação por RNase e ácido nucleico.
5. Quando este produto for usado com outros reagentes, siga as instruções experimentais específicas para operar.
6. Para obter bons resultados de purificação, você precisa ter boa integridade do RNA total e garantir que o valor de RIN seja >7,0.