Hifair™ Kit de sonda RT-qPCR multiplex de uma etapa V (UDG Mais) é um kit multiplex de PCR quantitativo baseado em RNA como molde. No processo do experimento, a transcrição reversa e a PCR quantitativa foram realizadas no mesmo tubo, o que simplificou a operação experimental e reduziu o risco de contaminação.

Neste kit, a primeira fita de cDNA foi sintetizada eficientemente pelo Hifair resistente ao calor^TM V Transcriptase reversa e amplificada quantitativamente por UNICON^TM HotStart Taq DNA Polymerase. O kit contém principalmente tampão MP otimizado, mistura de enzimas, etc. A solução tampão já contém Mg²⁺ e dNTP. Além disso, os fatores que podem efetivamente inibir a amplificação de PCR não específica e melhorar a eficiência de amplificação de múltiplas reações de qPCR são adicionados, o que pode garantir a eficiência de amplificação e realizar até múltiplas reações de amplificação. O sistema dUTP/UDG foi adicionado para efetivamente prevenir o risco de contaminação por aerossol.

Características

Alta sensibilidade：O sistema de buffer cuidadosamente otimizado melhora a sensibilidade de detecção de modelos de baixa concentração de até 250 cópias/mL；

Super estabilidade: O produto passou por testes de estabilidade em tempo real por 18 meses.

Sistema antipoluição dUP/UDG：O sistema antipoluição dUTP/UDG é introduzido para degradar a poluição por aerossol de produtos de forma eficiente, reduzir falsos positivos e garantir resultados autênticos；

Suporte ao programa rápido: compatível com programa rápido, 40 minutos podem produzir resultados;

Componentes

Observação: 1) 2×Hifair^TM Buffer V MP é a abreviação de Hifair^TM Tampão de sonda RT-qPCR multiplex de uma etapa V, que inclui dNTPs, dUTP, Mg2+, estabilizadores, intensificadores e muito mais.

2) Hifair^TM Mistura de enzimas V contém principalmente Hifair resistente ao calor^TM V transcriptase reversa, UNICONTM Polímeros de DNA HotStart Taq e UDGase.

Armazenar

Eele produto deve ser armazenado no -25°C~-15°C para 18 meses.

Instruções

Composição da reação

Observação：Misture bem antes de usar, evite bolhas excessivas causadas por vibração violenta.

a) Cartilha/Sonda concentração: Cartilha mistura incluindo primer multiplex, dependendo da situação, a concentração ideal do primer pode estar entre 0,1 e 1,0 μM.Mistura de sondas incluindo diferença de marcação de sonda multiplex grupo fluorescente, dependendo da situação a concentração ideal da sonda pode estar entre 0,05 e 0.5 μM.

c) Diluição do template: qPCR é altamente sensível e é recomendado diluir o template. O valor de Ct de controle é adequado entre 20 e 35.

e) Preparação do sistema: descabece com elemento filtrante. Evite contaminação cruzada e contaminação por aerossol.

Protocolo de Ciclismo Otimizado

Observação：a) Rtranscrição reversa: A temperatura pode selecionar 42°C ou 50°C por 10-15 minutos.

b) Reação de amplificação: A temperatura é ajustada de acordo com o valor de Tm dos primers projetados.

c) Aquisição de sinal de fluorescência: Defina o procedimento experimental de acordo com os requisitos do manual do instrumento.

3. Aplicativo equipamento

Equipamento com Rox：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Rápido, StepOne™, StepOne Plus™

Equipamento com Low Rox：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 e 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Equipamento sem Rox：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Ciência Aplicada LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Termo Ciclista científico PikoReal; Cefeida Ciclismo Inteligente®; Iluminar Eco qPCR

Notas

Use o EPI necessário, como jaleco e luvas, para garantir sua saúde e segurança！

Por favor, use consumíveis RNasefree para o experimento.

Teste de sensibilidade

Os 13650 armazenados a -20°C por 18 meses (grupo experimental) e aqueles dentro do prazo de validade (grupo controle) foram testados simultaneamente para a diluição do gradiente (500 cópias/ml, 250 cópias/ml) do pseudovírus SARS-CoV-2, visando o gene ORF e o gene N. Oito poços replicados foram testados para cada concentração, com uma taxa de detecção de 100%. Além disso, não houve diferenças significativas nas formas de pico da curva de amplificação e nos valores de Ct.

Teste de estabilidade em tempo real

Os 13650 armazenados a -20°C por 18 meses e aqueles dentro de seu prazo de validade. Ambos os grupos foram testados simultaneamente para o gene ORF do pseudovírus SARS-CoV-2 e o gene N em uma concentração de 1000 cópias/ml com 20 poços replicados. A taxa de detecção para ambos foi de 100%, e não houve diferenças significativas no formato das curvas de amplificação ou nos valores de Ct.

Figura 1. Redição: 13650 dentro do prazo de validade；azul：13650 armazenado a -20°C por 18 meses。

Desempenho estável após ciclos repetidos de congelamento e descongelamento

Submetendo o reagente 13650 a 30 e 50 ciclos de congelamento e descongelamento usando gelo seco, juntamente com reagentes armazenados normalmente a -20 °C e testando simultaneamente o gene ORF do pseudovírus SARS-CoV-2, os resultados indicaram que o desempenho do reagente 13650 não foi afetado após 50 ciclos de congelamento e descongelamento.

Figura 2. Vermelho: 13650 armazenado normalmente a -20°C; Roxo：13650 a 30 ciclos de congelamento e descongelamento；Verde：13650 a 50 ciclos de congelamento e descongelamento.

Compatível com protocolos padrão e rápidos

Usando 13650ES, o gene ORF e o gene N do pseudovírus SARS-CoV-2 foram detectados sob o mesmo sistema de reação com protocolos padrão e rápido. Os resultados mostraram que sob um sistema 4-plex, não houve diferença nas formas de pico da curva de amplificação e valores de Ct entre os dois protocolos.

Documentos:

Manuais