A amplificação não específica da Taq DNA polimerase é um problema comum em experimentos de PCR, que afeta diretamente a interpretação dos resultados de detecção e pode levar a uma diminuição na sensibilidade de amplificação e até mesmo uma redução no rendimento do fragmento alvo. Utilizar modificadores de enzimas para selar o centro ativo da Taq DNA polimerase em temperatura ambiente, inibindo assim a atividade da DNA polimerase da enzima Taq em temperatura ambiente, é atualmente o método mais eficaz para suprimir a amplificação não específica. Os anticorpos de selagem dupla desenvolvidos por Yisheng não apenas selam a atividade da polimerase da Taq DNA polimerase, mas também selam simultaneamente a atividade da exonuclease da Taq DNA polimerase. Essa abordagem dupla previne efetivamente a amplificação não específica causada por pareamento incorreto ou dímeros de primer e também previne a geração de sinais não específicos devido à degradação do material, aumentando assim duplamente a especificidade do reagente. Isso permite que os reagentes de detecção lidem com o transporte ou uso em temperatura ambiente com facilidade.

1.Especificidade de amplificação ultra-alta — O anticorpo duplamente selado pode selar simultaneamente as atividades da polimerase e da exonuclease, evitando efetivamente a amplificação não específica e aumentando a especificidade.

2.Sensibilidade de detecção excepcional — A formulação de partida a quente garante a detecção eficaz de genes de baixa abundância, oferecendo maior sensibilidade.

3.Excelente estabilidade do produto — Desempenho estável quando colocado a 37 °C por 5 dias ou a 4 °C por 10 dias.

4.Estabilidade da linha de base e boa linearidade — Abordando a questão do desvio da linha de base, resultando em excelente linearidade.

5.Liberação rápida da atividade enzimática — Mais de 95% da atividade enzimática pode ser liberada pelo aquecimento a 95 °C por 20 segundos.

6.Ampla aplicabilidade de enzimas — Adequado para enzimas Taq selvagens e mutantes, com cada mg de anticorpo capaz de selar 4-10 KU de enzima Taq.

1 Bloqueio da atividade da exonuclease da DNA polimerase Taq

Sondas de primer sintético foram incorporadas respectivamente nas misturas de reação da Taq DNA polimerase que foram seladas ou não seladas com anticorpos de fechamento duplo, e as reações foram conduzidas a 40°C. Os sinais de fluorescência de ambos foram detectados, e foi descoberto que os anticorpos de fechamento duplo podem selar efetivamente a atividade de exonuclease da Taq DNA polimerase.

Figura 2. Detecção da eficiência de selagem da atividade de anticorpo-endonuclease duplamente selada.

02 Verificação da sensibilidade de detecção

Utilizando, respectivamente, o anticorpo duplamente selado de Yeasen e o anticorpo da T Company para selar a enzima Taq, seguido pela detecção de amostras positivas por meio da tecnologia ARMS-PCR, descobriu-se que a enzima Taq selada pelo anticorpo duplamente selado de Yeasen foi precisa na amplificação ARMS-PCR com maior sensibilidade.

Vermelho:anticorpo YEASEN+Taq; Azul: fornecedor A anticorpo+Taq.

Figura 3. Curva de amplificação da ARMS-PCR.

03 Verificação de estabilidade (4°C por 10 dias, 37°C por 5 dias).

Usando anticorpos fechados tradicionais e anticorpos duplo-fechados para bloquear respectivamente a Taq DNA polimerase, a polimerase é então formulada em uma solução de pré-mistura completa contendo primers e sondas. Esta solução é deixada a 4°C por 10 dias ou a 37°C por 1, 3 e 5 dias, e então usada para amplificar 10.000 cópias do plasmídeo ASF. Foi observado que não houve mudanças significativas nas curvas de amplificação e valores de Ct.

Figura 4. Curvas de amplificação de 10.000 cópias do plasmídeo ASF após a polimerase Taq ter sido bloqueada com anticorpo bloqueador tradicional (A) e anticorpo bloqueado duplamente (B), amplificadas pelo sistema de qPCR.

04 Detecção de linha de base

Em certas condições em que primers específicos são usados ​​em conjunto com tampões e instrumentos particulares, um fenômeno conhecido como desvio de linha de base pode ocorrer. No entanto, o uso de anticorpos de fechamento duplo pode efetivamente abordar a questão do desvio de linha de base, facilitando assim uma linha de base mais estável.

Figura 5. Curvas de amplificação do gene N do SARS-CoV-2 (A) e do gene ACT (B) na análise de qPCR.

05 Verificação de Linearidade

A mistura de reação selada com anticorpos duplamente fechados foi usada para amplificar 100.000, 10.000, 1.000 e 100 cópias do plasmídeo duplo ASFV/ACT para gerar uma curva padrão. Como pode ser visto na Figura 7, ambos exibem boa linearidade.

Figura 6. Gráficos de curva padrão para o gene ASFV e o gene ACT gerados usando uma mistura de reação de bloco duplo.

06 Ensaio de liberação de atividade enzimática

Usando os anticorpos de fechamento duplo (Cat#31303) da Yeasen para selar a enzima Taq, e submetendo-a a um choque térmico a 95°C por 20 segundos, a atividade enzimática foi detectada. Pode-se observar que após um choque térmico de 20 segundos a 95°C, 31303 pode liberar mais de 95% da atividade enzimática, o que é comparável aos anticorpos da Empresa T.

Tabela 1. Choque térmico a 95°C por 20 segundos da enzima.

07 Detecção de polimerase Taq multiplex

Os anticorpos de duplo fechamento de Yeasen (Cat#31303) foram usados ​​para selar três tipos de Taq polimerases (tipo selvagem + dois tipos mutantes), com uma taxa de selagem de 1μg para 5U, e os valores de fluorescência e eficiência de selagem foram medidos. Foi descoberto que para diferentes tipos de Taq polimerases, os anticorpos de duplo fechamento de Yeasen (Cat#31303) exibiram bons efeitos de selagem.

Tabela 2. Eficiência bloqueada de diferentes tipos de Taq polimerase.