Descrição
O MycAway™ Mycoplasma qPCR Detection Kit é um produto projetado para detecção qualitativa de contaminação por micoplasma em várias fontes, incluindo matérias-primas, bancos de células, sementes de vírus, soluções de coleta de células ou vírus e células usadas em tratamentos clínicos, entre outros. Este kit utiliza sondas fluorescentes Taqman (FAM e VIC) e emprega técnicas de reação em cadeia da polimerase múltipla (PCR) para detectar separadamente o alvo e o controle interno. Ele foi validado para especificidade, limite de detecção e robustez de acordo com os padrões EP <2.6.7>, demonstrando alta sensibilidade, especificidade, eficiência e segurança. O limite de detecção é igual ou inferior a 10 UFC/mL.
Para extração de ácido nucleico, este produto pode ser usado em conjunto com o MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit (Cat#18461), que emprega métodos de extração manual. Como alternativa, os ácidos nucleicos em amostras podem ser extraídos automaticamente usando o extrator automático de ácido nucleico AutoPure 32A (Cat#80501) e o MolPure® Mag32 Residual DNA Sample Preparation Kit FA (Cat#18462). É importante observar que os kits contendo Cat#18461 e Cat#40619 passaram por uma validação abrangente; para obter informações detalhadas sobre validação, entre em contato com nosso suporte técnico. Após o pré-tratamento das amostras para remover impurezas interferentes e obter ácidos nucleicos purificados, uma reação de qPCR é realizada usando um amplificador de PCR em tempo real, e o sinal de fluorescência da sonda é coletado e analisado.
| Cat.No. | 40619ES25 / 40619ES60 |
| Tamanho | 25 T/100 T |
| Detecção Limite | 10 UFC/mL |
| Detectar método | qPCR método (Taqman fluorescente) |
| Duração | 4 horas |
| Fluorescente sonda | FAM (Alvo canal);VIC (Interno canal) |
| Abordado micoplasma | ≥ 100 |
| Validação | Validado de acordo com para EP <2.6.7> |
Componentes
| Componentes No. | Nome | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | Tampão de reação 4×MyqPCR | 250 μL | 1 mL |
| 40619-B | Meu Primer e Sonda MISTURA | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | Controle Interno (CI) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | Controle Positivo (CP) | 500 μL | 2 mL |
| 40619-E*** | Diluição de DNA amortecedor | 1 mL | 4×1 mL |
| 40619-F**** | Água ultrapura | 500 μL | 2×1 mL |
*IC: Interno controlar;
**PCS: Positivo controlar solução ,o concentração é 1.000 cópias/µL.
***ADN Diluição buffer: usado para CI diluição e o modelo de NTC e NCS.
****Ultrapuro água: usada para o preparação de qPCR Mistura.
Armazenar
Este produto deve ser armazenado entre -25 e -15℃ por 2 anos.
*Após o recebimento do kit, verifique se todos os componentes estão completos e armazene-os imediatamente em -25~-15℃ condição se não realizar o ensaio imediatamente. Observe que 40619-B deve ser armazenado longe da luz.
Instruções
- Preparativos antes do experimento
1） Prepare os reagentes e materiais necessários que serão usados no experimento.
2）Confirme a adequação de o instrumento qPCR
Este kit pode ser usado nos seguintes tipos de instrumentos de qPCR:
- Bio-Rad: CFX96
- Thermo Scientific: Sistema de PCR em tempo real 7500; QuantStudio™5;
- Método experimental
1） Extração de DNA
Recomendamos usar ' Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético (Cat#18461ES para extração manual e Cat#18462ES para extração automática) para o Extração de DNA, você pode visita ' http://www.youtube.com/watch?v=gYzQQwww.yeasenbiotech.com ' para o
informações detalhadas e a compra.
O kit (Cat#40619ES) contém um controle interno (IC). Se adicionar o IC às amostras antes da extração de DNA, ele pode verificar o processo completo (incluindo extração de DNA e reação de qPCR). Se adicionar o IC ao master mix de qPCR
diretamente, o CI atuará apenas como um controle qPCR.
2）Preparação da mistura qPCR
- De acordo com a quantidade de amostra que incluiu controle positivo (PCS), controle sem modelo (NTC), negativo solução de controle (NCS) e amostra de teste (TS) para calcular o número de reações. Prepare 2 reações em paralelo para
cada amostra em geral.
* PCS：Positivo controlar solução；NTC：Não modelo controle；NCS：Negativo controlar solução;TS:Teste amostra. Lá é não precisar para executar
o amostra extração para PCs e NTC, mas NCS e TS são necessário.
Poços de reação（M1）=（1×NCS + N×TS） ×2
Poços de reação (M2) = (1×PCS + 1×NTC) ×2
Poços de reação (M3) = (1×PCS + 1×NTC+ N×TS) ×2
- Pré-descongele a quantidade necessária de reagentes no gelo de acordo com o desenho do experimento e as tabelas abaixo.
- Calcule a quantidade de qPCR Mix de acordo com o Número de reações. Observe que, se o kit for usado para atividades de GMP, como liberação de produto, recomendamos usar a Tabela 1 e 2 para a preparação; Se o kit vai apenas usado para pesquisa e não há necessidade de adicionar IC antes da extração após a avaliação, siga a Tabela 3 para
a preparação. Observe que nem todos os M1, M2 e M3 são necessário para ser preparar.
| Componente | Volume（1×40μL Reações） | Volume（M1×40μL） |
| 4× Tampão de reação MyqPCR | 10 μL | (M1+2) ×10 μL |
| Meu Primer e Sonda MISTURA | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M1+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Água purificada | Até 20 μL | Até (M1+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M1+2) ×20 μL |
Tabela 1 Sistema qPCR Mix para M1
*O configuração sistema em Mesa 1 é baseado sobre o premissa que CI é adicionado antes extração para ambos NCS e TS, então isto é não necessário
para adicionar CI quando qPCR Mistura preparação. IC adicionando método antes extração: Primeiro, dilua CI por 20 vezes com ADN diluente, e adicionar 1μL
diluído CI em cada 100μL teste amostra para o avançar extração.
**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro
marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição.Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.
| Componente | Volume（1×40μL Reações） | Volume（M2×40μL） |
| 4× Tampão de reação MyqPCR | 10 μL | (M2+2) ×10 μL |
| Meu Primer e Sonda MISTURA | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| Controle Interno (CI) | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M2+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Purificado água | Até 20 μL | Até (M2+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M2+2) ×20 μL |
Tabela 2 Sistema qPCR Mix para M2
*O configuração sistema em Mesa 2 é baseado sobre o premissa que CI é não adicionado em PCs e NTC antes extração, então CI precisa para ser adicionado durante qPCR Mistura preparação. IC adicionando método depois extração: Diluir CI por 100 vezes com ADN diluente e adicionar 1μL diluído CI em
cada qPCR Mistura sistema.
**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro
marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição. Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.
| Componente | Volume（1×40μL Reações） | Volume（M3×40μL） |
| 4× Tampão de reação MyqPCR | 10 μL | (M3+2) ×10 μL |
| Meu Primer e Sonda MISTURA | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| Controle Interno (CI) | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M3+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Purificado água | Até 20 μL | Até (M3+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M3+2) ×20 μL |
Tabela 3 Sistema qPCR Mix para M3
*O configuração sistema em Mesa 3 é baseado sobre o premissa que CI é não adicionado para amostras antes extração, então CI precisa para ser adicionado durante qPCR Mistura preparação. IC adicionando método depois extração: Diluir CI por 100 vezes com ADN diluente e adicionar 1μL em cada qPCR Mistura
sistema.
**Esse conjunto faz não conter ROX Referência Tingir. Se ROX referência tingir é necessário para o Real Tempo PCR amplificadores que você são atualmente usando, 50×ROX Referência Tingir (Cat#10200ES) é recomendado para usar. Em esse caso, o adicionado volume é 0,8 μL, como mostrado em Mesa 1. Se usando outro
marcas de ROX produtos, por favor referir-se para deles instruções para ROX adição. Se não ROX referência tingir é necessário, o adicionado volume é 0 μL.
3）Adição de modelos
- Misture a mistura qPCR com agitação suficiente, centrifugue em baixa velocidade e colete o líquido residual da tampa
para o fundo de o tubo.
- Adicionar 20 μL qPCR Mix para cada tubo/poço de reação. Observe adicionar o qPCR Mix correspondente em cada
tubos de amostra e evitar adicionar erros.
- Adicione Templates ao tubo/poços que continham a qPCR Mix. Veja a Tabela 4 para adicionar os templates.
| Amostras de teste | Em cada tubo ou bem … |
| TS | 20 μL qPCR Mistura+20 Amostras de μL após extração |
| NTC | 20 μL qPCR Mistura+20 μL ADN Diluição amortecedor |
| NCS* | 20 μL qPCR Mistura+20 μL Amostra negativa após extração* |
| PCs | 20 μL qPCR Mistura +20 μL Positivo controlar |
Mesa 4 Modelos adicionando
*Recomendamos usar o tampão de diluição de DNA (40619-E) como modelo de NCS para extração de DNA.
**O total reação volume em cada tubo/poço é 40 μL.
***Cobrir o tubo tampa ou o placa filme. Para evitar afetando o fluorescência sinal lendo, por favor pegar cuidado não para marca o tubo tampa ou filme
ou até esfregar o filme repetidamente com um raspador.
****Centrífuga o reação tubo ou placa brevemente no baixo velocidade depois modelos adicionando. Depois suficiente tremendo e mistura, repetir centrifugar
no baixo velocidade para coletar o líquido de o tampa ou parede para o fundo. Evite bolhas quando operação. A linha de base vai ser impactado se o mistura
é não misturado bem, então esse etapa é muito importante para um bom experimentar resultado.
4）Configuração de programas qPCR
- Configurações do arquivo de programa
Exemplo (instrumento 7500 Real-Time PCR System e Real-Time PCR Software v2.4):
Tipo de instrumento: 7500 (96 poços)
Tipo de experimento: Quantificação-Curva Padrão;
Química: Reagentes Taqman®
Velocidade de rampa: Padrão (~2 horas para completar uma corrida)
- Configurações do canal de destino
Em "Definir Alvos e Amostras" de "Placa Configurar", criar um Alvo 1 canal (FAM), selecionar FAM como o relatando grupo de fluorescência e MGB ou nenhum como a têmpera fluorescência grupo. Criar um Alvo 2 canal (VIC), selecionar o relatando fluorescência grupo como VIC e o têmpera fluorescência grupo como nenhum. Em "Atribuir Alvos e Amostras" de "Placa Configurar", se não adicional ROX tingir é adicionado, selecione "nenhum"; Se um adicional ROX é adicionado, selecione
ROXO.
- Configurações do programa de amplificação padrão
| S/N | Estágio de reação | Temperatura | Tempo | Ciclo(s) |
| 1 | Desnaturação inicial | 95℃ | 5 mínimo | 1 |
| 2 | Desnaturação | 95℃ | 15 segundo |
45 |
| 3 | Recozimento/Extensão (coleta de sinal de fluorescência) |
62℃ |
30 segundos |
Tabela 5 Configurações do programa de amplificação padrão
- Definição de linha de base e limite:
Princípio de linha de base ajuste: usar o automático linha de base geralmente. Se precisar para ajustar em manual, escolher o ciclo antes do crescimento exponencial período como o ciclo inicial e evitar a zona de flutuação de inicial fluorescência coleção. Escolha o ciclo que é 1-2 ciclos antes do Ct da amostra de amplificação exponencial mais antiga como o
ponto final.
Princípio de limite ajuste: use o limite automático geralmente. Se precisar ajustar no manual, o limite deve ser definir mais alto que o Negativo amostra ou o linha de base barulho, isso é geralmente definir o limiar em o tarde
estágio de a amplificação exponencial, relativa independente e limiar adequado é necessária para cada túnel.
5） Resultado Análise
- Julgamento de resultados para PCS, NTC e NCS:
Se IC adicionado: a especificação de cada amostra de controle deve ser satisfeito na Tabela 6:
| Amostra de controle | FAM Sinal | Sinal VIC |
| PCs | Ct < 40 e tem curva de amplificação óbvia | Ct < 40 e tem curva de amplificação óbvia |
| NTC | Ct ≥ 40 ou nenhuma curva de amplificação óbvia | Ct < 40 e tem curva de amplificação óbvia |
| NCS | Ct ≥ 40 ou nenhuma curva de amplificação óbvia | Ct < 40 e tem curva de amplificação óbvia |
Mesa 6 Resultado julgamento de PCS, NTC e NCS
Se o IC não for adicionado: cada amostra de controle de qualidade deve atender à especificação da coluna de sinal FAM na Tabela 6, e nenhuma
precisa analisar Canal VIC.
- Resultado do julgamento para TS
Pré-requisito: Isto é necessário determinar se PC, NTC e NCS passou na especificação na tabela 6 antes do TS análise de resultados. Se aprovado, então pode prosseguir para o próximo passo. Se não passou, o TS resultados poderia não ser confiável, e
o motivo precisa ser investigado.
Se IC adicionado: encontre os resultados correspondentes julgamento de acordo com as informações de resultado do FAM e VIC na Tabela 7:
| FAM Sinal | Sinal VIC | Resultado julgamento |
| Ct<40 e tem óbvio curva de amplificação | Ct<40 e tem curva de amplificação óbvia | Positivo |
| Ct≥40 ou nenhuma curva de amplificação óbvia | Existe uma inibição, a experimento precisa ser repetido | |
| Ct≥40 ou nada óbvio curva de amplificação | Ct<40 e tem curva de amplificação óbvia | Negativo |
| Ct≥40 ou nenhuma curva de amplificação óbvia | Existe uma inibição, a experimento precisa ser repetido |
Mesa 7: Resultado julgamento de TS (CI adicionado)
*Se lá é inibição para VIC sinal,tratamento é necessário para eliminar o inibidores ou repita o teste.
Se IC não for adicionado: encontre os resultados correspondentes julgamento de acordo com as informações de resultado do FAM na Tabela 8 , e não há necessidade de analisar o Sinal VIC.
| Sinal FAM | Resultado julgamento |
| Ct<40 e tem curva de amplificação óbvia | Positivo |
| Ct≥40 ou nenhuma curva de amplificação óbvia | Negativo |
Mesa 8: Resultado julgamento de TS (CI não adicionado)
Notas
- Por favor, leia este manual cuidadosamente antes de usar este kit. O experimento deve ser conduzido de forma padronizada, incluindo manuseio de amostra, preparação do sistema de reação e adição de amostra.
- Mantenha as operações de adição de amostras e preparação de reagentes no gelo, se possível.
- Agite bem cada reagente no vortex antes de usar.
- Por favor, opere com jalecos e luvas descartáveis, para sua segurança.
- Este produto é somente para uso em pesquisa.
[1] Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C.Efeitos da suplementação dietética com galato de epigalocatequina na qualidade da carne e na capacidade antioxidante do músculo de frangos de corte submetidos a estresse agudo pelo calor. Animais (Basel). 2021;11(11):3296. Publicado em 18 de novembro de 2021. doi:10.3390/ani11113296(IF:2.752)
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