Polibreno (brometo de hexadimetrina), também conhecido como Polibreno, é um polímero catiônico comumente usado em experimentos de transfecção de DNA com células de mamíferos para aumentar a eficiência de transfecção de lipossomas. É amplamente empregado em transfecção de genes mediada por retrovírus e transfecção de genes mediada por lentivírus. O mecanismo de ação pode envolver a neutralização do ácido siálico na superfície da célula, facilitando a adsorção pela superação da repulsão eletrostática com partículas de vírus. O Polibreno também é reconhecido como um anticoagulante (antagonista da heparina) e é frequentemente usado na produção de hemácias agregadas não especificamente. Além disso, no sequenciamento de proteínas, baixas doses de Polibreno demonstraram melhorar significativamente a degradação de peptídeos na análise de sequenciamento automatizado. A adição de Polibreno às membranas de PVDF também pode aumentar a afinidade da membrana.

Especificação

O produto é fornecido em forma de solução, e o pó é reconstituído em 0,9% de NaCl para fazer uma solução de 10 mg/mL, que é então esterilizada usando um filtro de 0,22 μm. Ele é tipicamente diluído em uma proporção de 1:1000-1:2000 para uso, com proporções de diluição específicas dependendo do tipo de célula, conforme descrito na literatura relevante.

Envio e armazenamento

Transporte e armazenamento são recomendados a -20 ºC, com prazo de validade de 2 anos. É aconselhável aliquotar e armazenar para evitar ciclos repetidos de congelamento-degelo.

Precauções:

1. Use trajes de laboratório e luvas descartáveis ​​para segurança e saúde.

2. Este produto é apenas para fins de pesquisa.

Etapas operacionais

(para referência, as concentrações específicas podem variar, consulte a literatura relevante):

Observação: o polibreno pode apresentar toxicidade significativa para certas células (como neurônios terminalmente diferenciados, células DC), e um teste de toxicidade é recomendado para uso inicial.

Experimento 1: Infecção retroviral

1. Preparação do estoque de retrovírus recombinante: Cultive células contendo uma monocamada de células de embalagem de retrovírus de transfecção em uma placa de 100 mm com 5 mL de meio de crescimento (5% de soro). Após 24 horas, remova o meio de cultura e filtre-o através de um filtro de 0,45 μm.

2. Cultivo de células para infecção: Em uma placa de 100 mm, adicione 10 mL de meio de crescimento completo com densidade celular de 5×10⁵ por prato.

3. Infecção por vírus: Após 24 horas de cultura celular, remova o meio de cultura completo. Infecte as células com 2 mL de sobrenadante do vírus contendo Polybrene (concentração final: 5-10 μg/mL) a 37°C por 3-6 horas.

4. Coletar partículas virais: Adicionar 8 mL de meio de crescimento completo. Após 2-3 dias de cultura, coletar o meio de cultura para obter partículas virais.

Experimento 2: Transfecção

1. Cultivar células em meio de crescimento completo com densidade celular de aproximadamente 50%.

2. Após 18-24 horas de cultura celular, prepare uma mistura de meio de crescimento de DNA-polibreno. Adicione meio de crescimento completo (2 mL para uma placa de 60 mm, 3 mL para uma placa de 100 mm) e pré-aqueça a 37°C. Misture suavemente 10 ng~10 µg de plasmídeo. Adicione Polybrene a uma concentração final de 5-10 μg/mL. Misture delicadamente. Cada componente deve ser adicionado na ordem especificada.

3. Remova o meio de cultura e adicione a solução de meio de crescimento de DNA-Polybrene às células a 37°C por 6-20 horas. Misture suavemente a cada 1,5 horas nas primeiras 6 horas de cultura celular.

4. Remova o meio de crescimento de DNA-solução de Polybrene. Cubra as células com solução de choque DMSO (15% DMSO em 1× HBSS).Agite suavemente a placa de cultura por 10 segundos cada vez que a solução for adicionada para garantir uma distribuição uniforme. Incube as células a 37°C por 4 minutos.

5. Remova imediatamente a solução de choque DMSO e lave delicadamente as células duas vezes com meio de crescimento completo. Para uma placa de 60 mm, lave com 5 mL de meio de cultura a cada vez, e para uma placa de 100 mm, lave com 10 mL de meio de cultura a cada vez.

6. Adicione meio de crescimento completo às células.

7. Expressão de proteínas: Após 24-72 horas de cultura, colete células para análise de expressão de proteínas, conforme necessário.

Seleção de células: Após 24-72 horas de cultura, com base no estado das células, troque para um meio de seleção fresco e continue com a seleção de células.